4433
.pdf31
раствора голубого декстрана (ММ 107), насыщенного раствора рибофлавина (ММ 3-102) и 200 г/л гемоглобина (ММ 64,6-103). Раствор для фракционирования должен сначала впитаться гелем. Затем в колонку дважды вносят по 2 мл 0,9 % раствор NaCI. После этого подключают капельницу с 0,9 % раствором NaCI, предназначенным для элюирования разделяемых веществ. При разделении смеси для гель-фильтрации необходимо следить, чтобы в колонке был ток жидкости, т.е. открыт зажим снизу. По мере прохождения через колонку элюирующего раствора смесь разделяется на фракции, окрашенные в различные цвета. Каждую фракцию собирают в отдельную пробирку. В соответствии с относительной молекулярной массой быстрее всего элюируется декстран (голубой), а затем гемоглобин (красный) и рибофлавин (желтый). После элюирования смеси колонку промывают изотоническим раствором хлористого натрия до тех пор, пока гель не станет бесцветным, затем закрывают и оставляют небольшой слой раствора над гелем. Только после этого колонку можно использовать повторно.
Для выявления белка с содержимым каждой пробирки проводим биуретовую реакцию: добавляем по 6 капель NaOH и по 2 капли CuSO4. Наблюдают за появлением окраски.
Белки и аминокислоты можно выявить и с помощью нингидриновой реакции.
Для этого в каждую фракцию (пробирку) добавляют по 1 мл нингидринового реактива и ставят пробирки в кипящую водяную баню на 2 минуты. Во фракциях, содержащих белки или аминокислоты, появляется сине-фиолетовое окрашивание.
Лабораторная работа № 9 КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ
Цель работы: Определение количественного содержания белка с помощью биуретового метода.
Теоретическая часть
Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Реакция
32
обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения меди с пептидной группировкой белка.
Реактивы и оборудование
1) NaCl, 0,9 %; 2) биуретовый реактив: 0,15 г CuSO4 · 5H2O и 0,6 г
NaKC4H4O6 · 4H2O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н2О, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%- ого раствора NaOH (свободного от Na2CO3), добавляют 0,1 г KI и раствор доводят водой до 100 мл. Хранят в полиэтиленовой склянке; 3) стандартный раствор альбумина (БСА – бычий сывороточный альбумин), 10 мг белка в 1 мл; 4) раствор сыворотки с разведением в 10 раз: взять 1 мл сыворотки крови довести дистиллированной водой или 0,9 % раствором NaCl до объема 10 мл. Полученная концентрация белка будет соответствовать 6,5-8,5 г/л; 5) пробирки, пипетки; 6) ФЭК.
Экспериментальная часть
Ход работы: 1. Опытная проба: к 4 мл биуретового реактива добавляют, избегая образования пены, 1 мл приготовленного раствора сыворотки крови с 10-ти кратным разведением.
2. Контрольная проба: к 1 мл раствора хлорида натрия приливают 4 мл биуретового реактива.
Пробы делают в 2-х повторениях!
Через 45-50 мин опытную пробу колориметрируют на ФЭКе при длине волны 540 нм против контрольной пробы (либо против дистиллированной воды).
2.Расчет ведут по калибровочной кривой. Данные для построения калибровочного графика приведены в таблице 1.
33
|
|
|
|
|
Таблица 1 |
|
Данные для построения калибровочного графика |
||||
|
|
|
|
|
|
№ |
Рабочий р-р |
Стандартный |
0,9 % р-р |
Содержание |
Концентрация |
пробы |
биуретового |
р-р белка (мл) |
NaCl или |
белка в пробе (г) |
белка (г/л) |
|
реактива (мл) |
|
дист. Н2О |
|
|
|
|
|
(мл) |
|
|
|
|
|
|
|
|
1. |
4 |
0,2 |
0,8 |
0,002 |
2,0 |
|
|
|
|
|
|
2. |
4 |
0,4 |
0,6 |
0,004 |
4,0 |
|
|
|
|
|
|
3. |
4 |
0,6 |
0,4 |
0,006 |
6,0 |
|
|
|
|
|
|
4. |
4 |
0,8 |
0,2 |
0,008 |
8,0 |
|
|
|
|
|
|
5. |
4 |
1,0 |
0 |
0,010 |
10,0 |
|
|
|
|
|
|
При построении калибровочной кривой серию стандартных растворов обрабатывают так же, как и опытные пробы. Пробы перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего колориметрируют на ФЭКе при 540 нм против дистиллированной воды.
Измерения оптической плотности стандартных растворов начинают с растворов наименьшей концентрации.
Пробы делают в 2-х повторениях!
По результатам измерений строится калибровочная кривая. Средние значения оптической плотности (А) 2-х повторений (соответствующие различным концентрациям) наносят на миллиметровую бумагу на оси ординат, на оси абсцисс откладывают значения концентрации стандартных растворов белка (С).
Полученную по графику концентрацию белка в исследуемой опытной пробе умножают на величину разведения (х10).
Значения концентрации общего белка в сыворотке крови практически здоровых людей составляет 65-85 г/л.
Контрольные вопросы:
1.Опишите физико-химическую характеристику пептидной связи. Почему пептидные связи являются основой строения белка?
2.Как определить количество вещества с использованием калибровочной кривой?
34
3. Какова концентрация общего белка в сыворотке крови здорового человека?
Лабораторная работа № 10 ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ
Значение цветных реакций состоит в том, что они дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, растворах и установить аминокислотный состав различных природных белков. Эти реакции применяются как для качественного, так и для количественного определения белка и содержащихся в нем аминокислот. Некоторые реакции присущи не только белкам, но и другим веществам, например, фенол, подобно тирозину, дает ро- зово-красное окрашивание с реактивом Миллона, поэтому проведения одной какой-либо реакции для установления наличия белка не достаточно.
Существует два типа цветных реакций: 1) универсальные – биуретовая (на все белки) и нингидриновая (на все а-аминокислоты и белки); 2) специфические – только на определенные аминокислоты как в молекуле белка, так и в растворах отдельных аминокислот, например реакция Фоля (на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу), реакция Миллона (на тирозин), реакция Сакагучи (на аргинин) и др.
Опыт 1. Биуретовая реакция.
Биуретовая реакция – качественная на все без исключения белки, а также продукты их неполного гидролиза, которые содержат не менее двух пептидных связей.
Принцип метода. Биуретовая реакция обусловлена присутствием в белках пептидных связей (- СО – NH -), которые в щелочной среде образуют с сульфатом меди (ІІ) окрашенные в красно-фиолетовый цвет медные солеобразные комплексы. Биуретовую реакцию дают также некоторые небелковые веще-
ства, например биурет (NH2-CO-NH-CO-NH2), оксамид (NH2CO-CO-NH2),
ряд аминокислот (гистидин, серин, треонин, аспарагин).
35
Биуретовая реакция с глицином
Порядок выполнения работы.
К 1 мл исследуемого 1% раствора белка добавляют равный объем 10 % раствора гидроксида натрия (NaOH) щелочи и затем 2-3 капли 1 % раствора сульфата меди(CuSO4). разбавленного, почти бесцветного раствора медного купороса.
При положительной реакции появляется фиолетовая окраска с красным либо синим оттенком.
Опыт 2. Реакция на «слабосвязанную серу».
Принцип метода. Это реакция на цистеин и цистин. При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в цистеине и цистине достаточно легко отщепляется, в результате чего образуется сероводород, который, реагируя со щелочью, дает сульфиды натрия или калия. При добавлении ацетата свинца(II) образуется осадок сульфида свинца(II) серо-черного цвета.
Порядок выполнения работы.
В пробирку наливают 1 мл неразбавленного куриного белка, прибавляют 2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия. Смесь осторожно кипятят (чтобы смесь не выбросило).
При этом выделяется аммиак, который обнаруживается по посинению влажной лакмусовой бумажки, поднесенной к отверстию пробирки (не касаться
36
стенки). Образующийся незначительный осадок растворяется при кипении, а затем добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца(II):
Химизм реакции:
Опыт 3. Ксантопротеиновая реакция белков.
Принцип метода. Эта реакция используется для обнаружения a- аминокислот, содержащих ароматические радикалы. Тирозин, триптофан, фенилаланин при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образуют нитропроизводные, имеющие желтую окраску. В щелочной среде нитропроизводные этих a-аминокислот дают соли, окрашенные в оранжевый цвет.
37
Желатин, например, не содержащий ароматических аминокислот, не дает ксантопротеиновой пробы.
Порядок выполнения работы.
К 1 мл 10 %-го раствора белка куриного яйца добавляют 0,5 мл концентрированной азотной кислоты. В результате коагуляции белка в содержимом пробирки образуется белый осадок или помутнение. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется в результате гидролиза. После охлаждения добавляют 1–2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия (до появления оранжевой окраски раствора).
Рассмотрим механизм ксантопротеиновой реакции по радикалу тирозина:
Химизм реакции:
38
Лабораторная работа № 11
КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ БЕЛКА
Цель работы: ознакомиться с реакцией гидролиза простого белка.
Теоретическая часть
Гидролиз – распад сложного вещества на более простые составные части, связанный с присоединением воды по месту разрыва связей. В зависимости от применяемого катализатора различают кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз. При гидролизе простого белка конечными продуктами являются только аминокислоты. В организме гидролиз белка постоянно происходит в процессе, как пищеварения, так и жизнедеятельности клеток под действием протеолитических ферментов.
При кислотном гидролизе белка разрушаются некоторые аминокислоты: триптофан подвергается полному разрушению, а серин, треонин, цистин, тирозин, фенилаланин – частичному. Однако процент разрушения этих аминокислот невелик. При щелочном гидролизе белка отмечается более сильное разрушение аминокислот. Гидролизаты белка применяются в качестве лечебных препаратов.
При кислотном гидролизе белки распадаются сначала на высокомолекулярные пептиды, затем на низкомолекулярные пептиды, дипептиды и, наконец, на аминокислоты.
Полный гидролиз белка протекает при многочасовом кипячении раствора в круглодонной колбе с воздушным холодильнике в присутствии соляной или серной кислоты.
Реактивы и оборудование
1) раствор яичного белка; 2) HCl, конц.; 3) NaOH, 10 %; 4) H2SO4, 1 %; 5)
круглодонная колба с воздушным холодильником; 6) электрическая плитка с асбестовой сеткой; 7) штатив.
Экспериментальная часть
Ход работы:
1. Кислотный гидролиз простого белка. Для гидролиза в круглодонную колбу отмеривают 20 мл раствора яичного белка и 5 мл концентрированной соляной кислоты, колбу закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой и за-
39
крепляют на штативе с асбестовой сеткой. Содержимое кипятят (под тягой) 45-
90мин.
2.Открытие промежуточных продуктов распада белка в гидролизате при помощи биуретовой реакции. По окончании кипячения в пробирку наливают 5 капель гидролизата белка и нейтрализуют 10 % раствором щелочи по красному лакмусу (опускают кусочек лакмуса в пробирку и помешивают стеклянной палочкой). После нейтрализации гидролизата (при посинении лакмуса) проводят биуретовую реакцию, прибавляя 2 капли CuSO4.
Промежуточные продукты распада белка – пептоны – при проведении биуретовой реакции дают розовое или красное окрашивание, а белки – синефиолетовое.
При полном гидролизе белка (2,5 часа) до аминокислот биуретовая реакция с гидролизатом белка отрицательная.
Лабораторная работа № 12
КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА КОМПОНЕНТЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Цель работы: закрепить теоретические знания по теме «Нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды» и приобрести навыки качественного определения компонентов нуклеиновых кислот, образующихся в результате гидролиза нуклеопротеидов.
Теоретическая часть
Для изучения состава нуклеопротеидов проводят кислотный гидролиз дрожжей в присутствии серной кислоты. При непродолжительном гидролизе нуклеопротеиды распадаются на белок и нуклеиновые кислоты. При продолжительном гидролизе наступает полный распад нуклеопротеидов. С помощью специальных реакций можно открыть в гидролизате составные части нуклеопротеидов. Биуретовой реакцией устанавливают наличие полипептидов. Пуриновые основания открывают по образованию осадка серебряных солей, фосфорную кислоту – по реакции с молибдатом аммония, а пентозу – пробой Троммера.
40
Исследуемый материал: пекарские дрожжи.
Реактивы и оборудование:
1.10% раствор серной кислоты.
2.Аммиак концентрированный.
3.2% аммиачный раствор нитрата серебра (к 2% раствору нитрата серебра добавляют концентрированный раствор аммиака до растворения осадка).
4.10% раствор NaOH.
5.7% раствор CuSO4.
6.1% раствор CuSO4.
7.Молибдат аммония в азотной кислоте (7,5 г молибдата аммония растворяют в 100 мл воды и добавляют 100 мл 32% раствора азотной кислоты; полное растворение молибдата аммония происходит после добавления азотной кислоты).
8.1% раствор аскорбиновой кислоты на 1М растворе HCl.
9.Большая пробирка или круглодонная колба с пробкой, в которую вставлена длинная стеклянная трубка.
10.Песчаная баня.
11.Штатив с пробирками.
12.Пипетки.
13.Индикаторная бумага.
Экспериментальная часть
Ход работы: Помещают 1 г пекарских дрожжей в большую пробирку или круглодонную колбу, добавляют 20 мл 10% раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды, закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой и кипятят под тягой в течение часа. После прекращения кипячения, охлаждают, фильтруют. С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеопротеидов.
1. Серебряная проба на пуриновые основания.
Метод основан на способности пуриновых оснований с аммиачным раствором нитрата серебра образовывать осадок серебряных солей пуриновых оснований, окрашенных в светло-коричневый цвет.