Химия. Эконология. Биотехнология

УДК 579.222.3

А.Д. Жуланова, В.П. Коробов, Л.М. Лемкина

Пермский национальный исследовательский политехнический университет,

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО СОЕДИНЕНИЯ, ПРОДУЦИРУЕМОГО ШТАММОМ STAPHYLOCOCCUS HAEMOLYTICUS, И ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ДАННОГО МЕТОДА

Широкое распространение заболеваний бактериальной этиологии и быстрое появление устойчивых к антибактериальным средствам штаммов-возбудителей определяют интерес к поиску новых эффективных антибиотиков. Как следствие широкого использования, практически у всех патогенных бактерий, среди которых основное место занимают стафилококки, обнаружены разные уровни резистентности к антибактериальным препаратам.

Вкачестве средств антибактериального действия больший интерес вызывают бактериоцины микроорганизмов. Известны примеры практического использования наиболее изученных бактериоцинов лактобактерий – низина и педиоцина – в качестве биоконсервантов пищевых продуктов и кормов.

Цель работы – изучение условий продукции антибактериального соединения одним из штаммов лабораторной коллекции стафилококков (ЛБРМ ИЭГМ УрО РАН, №117) с выделением антибактериального фактора и оценкой экологической безопасности метода получения этого соединения.

Вработе была проведена идентификация штаммапродуцента №117, проявляющего активность по отношению к индикаторной культуре Staphylococcus epidermidis 33, получен-

101

elib.pstu.ru

ной из ГНИИСК МБП имени Л.А. Тарасевича (Москва). Для этого использовались наборы STAPHYTest 24 Lachema (Чехия)

и КВ004R HiStaph HiMedia Laboratories (Индия). По идентифи-

кационным таблицам и книге кодов (STAPHYTest 24) штамм был идентифицирован как один из представителей вида Staphylococcus haemolyticus.

При проведении периодического культивирования в колбах с отбойниками и без них на жидкой питательной среде, разработанной сотрудниками ЛБРМ ИЭГМ УрО РАН, на шейкере SARTORIUS СERTOMATIS (Германия) при 150 об/мин и температуре 37 °С, построена кривая роста штамма с определением числа КОЕ и антибактериальной активности супернатантов среды культивирования. Было показано, что при увеличении оптической плотности продукция антибактериального соединения возрастает и достигает максимального уровня при переходе в стационарную фазу роста (6–9 ч культивирования).

Проведены предварительная очистка и концентрирование антибактериального фактора методом ионообменной хроматографии на колонке со смолой Toyepearl-SP 650M с использованием градиента NaCl. Фракции элюата тестировали на содержание в них антибактериальной активности на плотной питательной среде. Выделено 2 фракции, обладающие антибактериальной активностью.

Так как присутствие большой концентрации NaCl в полученных после хроматографии пробах мешает проявлению антибактериальной активности, отобранные пробы первой фракции подвергали обессоливанию на колонке с сефадексом G-25.

В настоящий момент проводится исследование экологической безопасности данного метода. Биомасса после культивирования и центрифугирования утилизируется согласно санитарным правилам СП 1.2.731–99 «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности и гельминтами». Оценка экологической безопасности фракций, обладающих антибактериальной активностью, проводится путем определения индекса прорастания семян редиса посевного.

102

elib.pstu.ru

УДК 615.281.8

Л.Г. Степаненко, М.Г. Ефимова

Пермский национальный исследовательский политехнический университет,

НПО «Микроген» МЗ РФ, Пермское НПО «Биомед»

МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВА ЖИДКОГО СЕКСТАФАГА

Лечение заболеваний инфекционной природы является одной из центральных задач современной медицины и представляет существенную проблему как с клинических, так и с эпидемиологических позиций. К числу наиболее часто встречающихся заболеваний относятся инфекции, вызванные условно патогенными микроорганизмами, в том числе Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. Традиционными препа-

ратами этиотропной терапии гнойно-воспалительных заболеваний являются антибиотики. Однако применение антибиотиков сопряжено не только с гибелью патогенных агентов, поддерживающих инфекционный процесс, но и с нарушением жизнедеятельности организма – поражение органов и функциональных систем. Вопрос об успешной профилактике и терапии гнойносептических инфекций приобретает чрезвычайную актуальность в условиях формирования полирезистентности микроорганизмов к антибиотикам. В связи c этим интенсифицируются исследования по совершенствованию и разработке альтернативных методов лечения, в том числе и фаготерапии. Основными достоинствами препаратов бактериофагов являются: высокая чувствительность патогенной микрофлоры к бактериофагам, сочетаемость со всеми видами традиционной антибактериальной терапии, отсутствие противопоказаний к фагопрофилактике и фаготерапии.

103

elib.pstu.ru

Всфере фагового производства актуальны задачи, связанные с конструированием новых препаратов и усовершенствованием технологического процесса, включая отбор и использование высокочувствительных штаммов-продуцентов, разработку питательных сред для культивирования бактериофагов, изготовление более широкой номенклатуры лекарственных форм.

Вусловиях полиэтиологичности многих заболеваний, вызванных условно патогенными микроорганизмами, наиболее целесообразно создание поливалентных комбинированных бактериофагов. Распространенными формами выпуска препаратов бактериофагов являются жидкие лекарственные формы и таблетированные фаги кишечной группы. Среди различных способов введения лекарств широкое распространение в медицинской практике получает ректальный способ, преимуществами которого являются: попадание лекарственного вещества непосредственно в общий кровоток, увеличение скорости всасывания, уменьшение частоты аллергезирующего действия, простота, безболезненность введения.

Всвязи с вышеизложенным целью настоящего исследования является разработка биологических и технологических аспектов получения комбинированного фагового препарата, направленного против условно-патогенных микроорганизмов: стафилококков, стрептококков, синегнойной и кишечной палочек, протеев, клебсиелл.

104

elib.pstu.ru

УДК 615.381

Ю.С. Антропова, Л.В. Волкова

Пермский национальный исследовательский политехнический университет,

НПО «Микроген» МЗ РФ, Пермское НПО «Биомед»

МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА ДЕПИРОГЕНИЗАЦИИ ПРЕПАРАТА «ИММУНОГЛОБУЛИН ЧЕЛОВЕКА НОРМАЛЬНЫЙ ДЛЯ ВНУТРИМЫШЕЧНОГО ВВЕДЕНИЯ»

Препарат «Иммуноглобулин человека нормальный для внутримышечного введения» выпускается в Российской Федерации многими предприятиями иммунобиологического профиля и станциями переливания крови. Данный препарат широко применяется для профилактики гепатита A и кори, а в некоторых странах и при краснухе, ветряной оспе и для иммунозаместительной терапии.

В настоящее время препараты иммуноглобулинов для внутримышечного введения имеют, как правило, две стандартные формы выпуска – 10 и 16 %. Так, в Австралии «Иммуноглобулин человека нормальный для внутримышечного введения» выпускается в виде 16,0 %, в США – 16,5 %, ранее в Англии – 10,0 % раствора (NH MRC, 2003), а в РФ, как правило, в виде

9,5–10,5 % раствора (Ляпунов Н.А., 2004).

На предприятии НПО «Биомед» препарат «Иммуноглобулин человека нормальный для внутримышечного введения» производится в виде инфузионного 10 % раствора. Основным способом промышленного получения данного препарата на предприятии является фракционирование плазмы крови этиловым спиртом по Кону (Минакова Л.В., Козлова Н.Е., 1993). Преимуществом метода является его хорошая воспроизводимость при крупномасштабном производстве, сравнительная простота и надежность удаления этанола, удовлетворительный

105

elib.pstu.ru

выход и чистота препарата. Получение иммуноглобулина (ИГ) данным способом предусматривает большое количество стадий (фильтрация плазмы, осаждение осадка А8, отделение осадка А8 центрифугированием, отделение глобулинов от альбуминов и т.д.), каждая из которых осуществляется в определенном аппарате и при определенном температурном режиме, рН, ионной силе и различных концентрациях этилового спирта. При этом вероятность загрязнения препарата пирогенными веществами возникает на любой стадии его производства, поэтому осуществляется постоянный отбор проб на «пирогенный» контроль препарата.

Изначально для удаления пирогенных веществ на предприятии НПО «Биомед» использовали метод длительного выстаивания препарата, основными параметрами которого являются время и температура. Данный метод заключается в том, что после осветляющей и стерилизующей фильтрации препарат выстаивают при комнатной температуре (18–24 °С) в течение 30 дней, а затем его переносят в камеру Фриго (+2…+8 °С), где он подвергается дополнительному выстаиванию в течение двух недель. Этот метод позволяет снимать пирогенные вещества с препарата, не теряя его активности. Однако недостатком метода является его длительность, которая в свою очередь уменьшает срок хранения препарата.

Следующим методом снятия пирогена в препаратах ИГ является использование алюминия гидроксида в лиофилизированной форме. Однако практический опыт показал, что при рН 5,0 и замене алюминия гидроксида в порошке на 1%-ю суспензию алюминия гидроксида дает большую эффективность удаления пирогена.

В настоящее время на базе ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, Пермское НПО «Биомед» апробируются два метода депирогенизации ИГ: с использованием 1%-й суспензии алюминия гидроксида и ультрафильтрации на разделительных мембранах.

Таким образом, проблема разработки технологии удаления пирогенных веществ из препарата ИГ, максимально удовлетво-

106

elib.pstu.ru

ряющего требованиям Европейской фармакопеи, остается актуальной. В связи с этим целью настоящего исследования является совершенствование технологии удаления пирогенных веществ из препарата «Иммуноглобулин человека нормальный для внутримышечного введения» для повышения его качества.

УДК 554.032.6

А.Г. Старостин

Пермский национальный исследовательский политехнический университет

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОКРЫТИЙ ДИОКСИДА МАРГАНЦА НА ТАНТАЛОВЫХ АНОДАХ КОНДЕНСАТОРОВ

Пленки диоксида марганца используют в электронной промышленности при производстве конденсаторов, в частности на автоматизированной линии завода ОАО «Элеконд», г. Сарапул. Выпуск продукции осложнен длинным технологическим циклом, что приводит к появлению бракованной продукции. Изучение жизненного цикла продукции выявило пути совершенствования технологии производства. Кафедрой технологии неорганических веществ ПНИПУ разработан способ получения пленок диоксида марганца на пористых танталовых анодах конденсаторов. В основе способа использован эффект ускорения зародышеобразования MnO2 под действием ультразвуковой обработки прекурсоров до стадии пиролиза. Это позволяет получить в прекурсоре зародыши диоксида марганца нанометрового размера, способствующие образованию ровного покрытия, с низким числом дефектов, и повысить надежность работы конденсатора – снизить токи утечки, увеличить емкость (рис. 1, 2).

107

elib.pstu.ru

С использованием уникального оборудования (электронного и оптического микроскопов «HITACHI S-3400N» + BRUKER, «Carl ZEISS Axio Imager M2m») установлены условия получе-

ния качественных покрытий диоксида марганца на танталовых анодах конденсаторов.

Разработанный способ может также использоваться для производства марганцевых катализаторов, что установлено с помощью приборов термопрограммируемой десорбции, синхронного термического анализа и рентгеновского дифрактомет-

ра («TPD Micromeritics», «STA NETZSCH 449C Jupiter», «XRD7000 SHIMADZU»).

108

elib.pstu.ru

УДК 579.222

А.В. Лапицкий, Л.М. Лемкина, В.П. Коробов

Пермский национальный исследовательский политехнический университет,

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ ГРАНУЛ PE-103 В ПРОЦЕССЕ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПЕПТИДА ВАРНЕРИНА

Многолетнее широкое использование в клинической практике различных синтетических антибиотиков вызывает появление резистентных к ним штаммов бактерий, что создает необходимость поиска новых антибактериальных препаратов. В последнее время большое внимание уделяется бактериоцинам – веществам белковой природы, которые синтезируются самими бактериями и являются следствием микробного антагонизма. В плане поиска альтернативы традиционным антибиотикам бактериоцины привлекательны такими своими качествами, как специфичность антимикробного действия, природное происхождение (натуральность), универсальность и эффективность механизма поражения бактериальных клеток, а также сравнительно низкая частота появлениярезистентных кним штаммов бактерий.

Бактериоцины являются перспективным продуктом для промышленного производства. Однако ограничивающим фактором при этом является небольшая, как правило, биосинтетическая активность продуцента. Поэтому одной из основных практических задач, требующих решения, является подбор таких условий культивирования, при которых образование антибактериальных пептидов будет значительно возрастать.

В лаборатории биохимии развития микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН В.П. Коробовым с сотрудниками был обнару-

109

elib.pstu.ru

жен низкомолекулярный пептид, продуцируемый штаммом

Staphylococcus warneri IEGM KL-1, подавляющий рост грампо-

ложительных микроорганизмов. Пептид был выделен из супернатантов сред культивирования продуцентов с помощью хроматографии на катионообменной смоле Toypearl-SP 650M, а затем очищен от посторонних фракций с использованием ВЭЖХ. Установлено, что это катионный пептид с молекулярной массой 2999 Dа. По совокупности выявленных характеристик, происхождению и в соответствии с видовой принадлежностью продуцента пептид получил название варнерин.

Цель настоящей работы – оптимизировать процесс получения антибактериального катионного пептида варнерина для подготовки переноса его в промышленное производство. Ранее было обнаружено, что при культивировании продуцента варнерина в среде, содержащей полимерные гранулы PE-103, антибактериальная активность супернатантов резко увеличивается по сравнению с их активностью при культивировании без гранул.

Для того чтобы определить оптимальное соотношение между количеством гранул и интенсивностью синтеза антибактериального фактора, нами были поставлены эксперименты по культивированию штамма S. warneri IEGM KL-1 в колбах с отбойниками при разных массовых соотношениях среды и гранул

PE-103 (20:1, 10:1, 5:1, 4:1). Установлено, что наибольшая анти-

бактериальная активность супернатантов среды культивирования достигалась при соотношении среды и гранул, равном 5:1.

Для определения оптимального числа циклов использования гранул были поставлены эксперименты по культивированию штамма S. warneri IEGM KL-1 в среде с гранулами разных сроков эксплуатации. После каждого использования гранулы подвергались обработке, включающей в себя их очистку (промывание в проточной и дистиллированной воде, замачивание в медицинском спирте в течение суток) и последующую стерилизацию в автоклаве при 1,5 атм в течение часа. Установлено, что антибактериальная активность супернатантов, полученных при культивировании штамма с гранулами, существенно снижается

110

elib.pstu.ru