7 семестр / Лекция-Белки

22

белков из разных видов используют для построения эволюционных карт, отражающих последовательные этапы возникновения и развития различных видов животных и растений в процессе эволюции.

Протеом — термин для обозначения совокупности белков (протеинов) организма. Термин был предложен в 1994 году австралийским исследователем Марком Уилкинсом. Исследование протеома — крупный международный научный проект. В 2001 году для работы над ним была создана международная Организация протеома человека (Human Proteome Organization/HUPO). Особое внимание участников проекта вызывают белки крови, печени и головного мозга.

Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей

Определение аминокислотной последовательности полипептидной цепи основано на принципах, которые впервые были развиты Сэнглером. Чтобы расшифровать аминокислотную последовательность любого пептида, необходимо осуществить шесть основных стадий.

Стадия 1: определение аминокислотного состава

Осуществляет гидролиз всех пептидных связей чистого пептида. Белок нагревают с растворами кислот или щелочей при температуре 100-1050С в течение суток, чаще используют 20% соляную кислоту. Образующаяся смесь аминокислот анализируетс при помощи ионообменной хроматографии, что позволяет определить, какие аминокислоты и в каком соотношении присутствуют в гидролизате.

Стадия 2: идентификация амино- и карбоксиконцевых остатков

Для определения N-концевой аминокислоты Сэнгер предложил использовать реагент 1-фтро-2.4-динитрофенол, который можно присоединить в качестве метки к аминоконцевому остатку цепи, в результате образуется окрашенное в желтый цвет 2,4-динитрофенильное (ДНФ)- производное полипептида. При гидролизе образуется смесь аминокислот, в которой только концевые аминокислоты представлены в вде ДНФпроизводных. Это производное легко отделить и идентифицировать хроматографически. Другим специфическим реагентов-меткой является дансилхлорид. Дансилпроизводное сильно флуоресцирует.

С-концевой остаток аминокислоты можно определить, инкубируя полипептид с карбоксипептидазой – ферментом, способным гидролизовать пептидную связь только на карбоксильном конце пептидной цепи.

Стадия 3: расщепление полипептидной цепи на фрагменты

Еще одну порцию неповрежденного препарата расщепляют на более мелкие куски – короткие пептиды, состоящие из 10-15 аминокислотных остатков. Цель данной операции (стадия 3) заключается в том, чтобы разделить полученные фрагменты и определить в каждом из них аминокислотную последовательность.

Для расщепления полипептидной цепи на фрагменты можно использовать несколько методов: частичный ферментативный гидролиз под действием трипсина – один из наиболее распространенных. Трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвовала карбоксильная группа лизина или аргинина. Иногда используют и другие ферменты (табл.4).

Таблица 4. Специфичность некоторых пептидаз.

Фрагменты, полученные под действием ферментов разделяют методом ионной хроматографии, или при помощи электрофореза и хроматографии на бумаге, в результате чего получают хроматоргамму с распределившимися на ней пептидами в виде пептидной карты.

Стадия 4: определение последовательности пептидных фрагментов

Для установления последовательности используют химический метод Эдмана. Расщепление по Эдману сводится к тому, что метится и отщепляется только N-концевой остаток пептида. После идентификации отщепленного остатка снова вводится метка и отщепляют очередной остаток. В качестве метки применяют фенилизотиоцианат, который присоединяется по свободной -аминогруппе с образованием фенилизотиоцианатного производного. Обработка пептида холодной разбавленной соляной кислотой приводит к избирательному отщеплению N- концевой аминокислоты в виде производного.

Стадия 5: расщепление исходной полипептидной цепи еще одним способом

Чтобы установить порядок расположения пептидных фрагментов, образовавшихся под действием трипсина, берут новую порцию препарата исходного полипептида и расщепляют его на более мелкие фрагменты другим способом. Особенно хорошие результаты дает бромциан. Полученные фрагменты разделяют и расщепляют по Эдману.

Стадия 6: установление порядка расположения пептидных фрагментов по перекрывающимся участкам

25

Сравнивают аминокислотные последовательности пептидных фрагментов, полученных двумя способами. Если второго расщепления недостаточно, то проводят третье расщепление с определением аминокислотной последовательности во всех фрагментах.

В настоящее время метод Эдмана реализуется в специально созданном приборе – секвенаторе, который позволяет автоматически определять аминокислотную последовательность в пепидах, содержащих до 70 аминокислотных остатков.