7 семестр / Методичка

ной сетчатой структурой. Например, гели полисахарида декстрана (коммерче-

ское название − сефадексы). При изготовлении сефадексов полисахаридные це-

пи декстрана соединяются поперечными сшивками. Существует несколько ти-

пов сефадекса, различающихся как размером и количеством, так и величиной гранул. Это позволяет применять их для разделения веществ с разными разме-

рами молекул. Благодаря высокому содержанию гидроксильных групп гранулы сефадекса легко набухают, образуя гель. Чем выше способность геля к набуха-

нию, тем больше номер сефадекса.

Сефадексы отличаются степенью сшивки молекул декстрана друг с дру-

гом. Это находит выражение в различной набухаемости гранул сефадекса и пределах эксклюзии (выражаемой значениями молекулярной массы веществ,

еще способных входить внутрь гранул сефадекса), в связи с чем и построена их классификация (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика некоторых видов сефадексов

Для освобождения белковых растворов от солей обычно используют се-

фадекс марки G-25.

Применение сефадексов для фракционирования сложных белковых сме-

сей типа тех, что характерны для биологических жидкостей (сыворотка крови,

гемолимфа беспозвоночных и т. п.) или экстрактов, полученных из животных и растительных тканей, малоэффективно: удается лишь разделить смесь белков на несколько групп. Тем не менее, в ряде случаев это первая стадия при выде-

лении индивидуальных белков. Сефадексы применяют также на заключитель-

30

ных этапах очистки белка от примеси сопутствующего белка, если последний достаточно резко отличается от первого по величине молекулярной массы.

В последнее время сефадексы применяют для определения молекулярной массы белков путем сопоставления величин свободного (т. е. не занятого гра-

нулами сефадекса) и элюируемого (т. е. необходимого для выноса белка из ко-

лонки) объемов колонки.

М а т е р и а л и с с л е д о в а н и я : яичный альбумин.

Р е а к т и в ы и о б о р у д о в а н и е : биуретовый реактив, колонка размером

1×25 см с гелем сефадекса G-25 (4 г в 0,09 М растворе хлорида натрия), 0,09 М

раствор хлорида натрия, бихромата калия, голубой декстран 1%-ный раствор,

мерный цилиндр, штатив с пробирками «Эппендорф» 1,5 мл, пипетки.

Х о д р а б о т ы .

1. Заполнение колонки5.

Заполнение гелем колонки ведут осторожно, заливая его медленно и не-

прерывно по стенке колонки, что предохраняет его от захвата пузырьков воз-

духа.

2. Определение объема водной фазы колонки Vо.

Открывают зажим на колонке и сливают 0,09 М раствор NaCl, на-

ходящийся над гелем. Зажим закрывают и на поверхность геля очень аккурат-

но, по стенке, с помощью пипетки наносят 0,5 мл раствора голубого декстрана.

Открывают зажим и вытекающую из колонки жидкость собирают в мерный цилиндр и сохраняют до конца опыта. Наблюдают за проникновением нане-

сенного раствора в гель (поверхность геля не должна оставаться сухой, поэтому по мере вытекания жидкости из колонки раствор NaCl доливают в колонку ли-

бо подсоединяют к колонке склянку с раствором).

Заранее готовят пять чистых пробирок. Как только из колонки начнет вы-

текать окрашенный (голубой) раствор, в эти пробирки собирают окрашенные

5 4 г сефадекса предварительно заливают 200 мл 0,09 М раствора хлорида натрия в литровом стакане, хорошо перемешивают и оставляют на 24 часа. Через сутки набухший сефадекс промывают 5 раз 0,09 М раствором хлорида натрия путем декантации. Затем стакан с гелем сефадекса помещают в большой вакуум эксикатор и в течение 1,5 часов деаэрируют под вакуумом, создаваемым водоструйным насосом, после чего гель готов для заполнения колонки.

31

фракции, по 0,5 мл в каждую пробирку. Элюат из этих пробирок от начала ря-

да, включая пробирку с самой интенсивной окраской, сливают в цилиндр, где уже собраны предыдущие (неокрашенные) фракции. Объем остальных проби-

рок, в которых окраска начинает ослабевать, не учитывается. Таким образом,

объем элюата от начала опыта до появления наиболее яркой голубой окраски составляет объем водной фазы колонки (Vo).

Закончив определение, колонку отмывают от следов голубого декстрана.

3. Обессоливание белкового раствора методом гель-фильтрации.

Перед нанесением раствора белка открывают кран и наблюдают за уменьшением столбика хлорида натрия над слоем сефадекса. Как только над поверхностью геля останется слой жидкости толщиной 1−2 мм, кран закрывают и аккуратно пипеткой наносят на гель 1 мл раствора белка, в который предва-

рительно добавляют 5 мг K2Cr2O7. Кран открывают и следят за проникновением раствора в гель. Снова закрывают кран и ополаскивают стенки колонки 1 мл хлорида натрия, открывают кран и позволяют жидкости впитаться в гель. Затем кран закрывают и аккуратно добавляют 4−6 мл хлорида натрия.

В 20 пробирок отмеряют 0,5 мл биуретового реактива. Собирают фракции с колонок по 20 капель (1 мл) в пробирки, содержащие биуретовый реактив. При этом не забывают добавлять в колонку хлорид натрия.

Наблюдают за изменением окраски в порциях элюата.

Гель в колонке отмывают водой до полного удаления K2Cr2O7.

О ф о р м л е н и е р а б о т ы . Описывают принцип метода и результаты за-

носят в таблицу. Делают выводы.

№ пробирки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Белок

K2Cr2O7

32

Работа 8. Разделение смеси белков методом электрофореза в

полиакриламидном геле

Цель работы – освоить методы ПААГ-электрофореза для характеристики белков.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле – метод разделения смеси белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов). Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии,

генетике.

Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов.

Для каждого белка существует такое значение рН среды (обозначаемое как рI – изоэлектрическая точка), при котором положительные и отрицательные заряды ионизированных групп будут скомпенсированы. Вследствие этого фак-

та, заряд всей белковой молекулы равен нулю. Таким образом, в буферном рас-

творе со значением рН = рI изучаемого белка, невозможно движение белковой молекулы в приложенном электрическом поле.

Из-за разницы в аминокислотном составе, все белки имеют разные значе-

ния рI. При рН ≠ pI молекулы белка приобретают заряд и под действием элек-

трического поля перемещаются к противоположно заряженным электродам – катоду(-) или аноду(+). Например, кислые белки, богатые моноаминодикарбо-

новыми аминокислотами (аспарагиновая кислота (Asp); глютаминовая кислота

(Glu), даже в буферном растворе со слабощелочным значением рН (8.0 – 8.5)

приобретут значительный суммарный отрицательный заряд, вследствие диссо-

циации карбоксильных групп на СОО- и H+ и будут двигаться к аноду.

33

Для электрофоретического разделения биологических макромолекул оп-

тимально такое значение рН рабочего буферного раствора, которое обусловли-

вает максимальное различие зарядов разных белков, составляющих исходную смесь, а не их максимальный заряд. Обычно электрофорез проводят в среде

(буфере) со значением рН, на 3 — 4 единицы отличающимся от среднего зна-

чения рI для белков данного типа. Это позволяет добиться хорошей электрофо-

ретической подвижности и, вместе с тем, сохранить ощутимые различия моле-

кул по заряду. Предпочтительно использовать буфер известной и постоянной ионной силы на основе однозарядных ионов. От рабочего буфера также требу-

ется существенная емкость, так как локальная концентрация белка в образую-

щихся при разделении смеси зонах скопления молекул может оказаться значи-

тельной. Поэтому используют буферы с концентрацией не менее 0.1 — 0.2 М.

При проведении электрофореза электрическое поле создают с помощью источ-

ника питания – стабилизированного выпрямителя, способного давать регули-

руемое напряжение до 100 – 1000 В, при силе тока в несколько десятков милли-

ампер (мА).

Электрофорез проводят в однородном электрическом поле, то есть в поле,

напряженность E которого во всех точках одинакова. Электрический ток про-

пускают через проводник – буферный раствор, налитый в канал из изолирую-

щего материала (например, стекла) или пропитывающий какую-либо поддер-

живающую среду – носитель (например, бумагу или гель). Сопротивле-

ние R буферного раствора задается двумя факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электрофоретической подвижностью. Электрофоретиче-

ской подвижностью (u) данной молекулы называют скорость движения заря-

женной молекулы (выражаемой в см/ч) в электрическом поле с напряженно-

стью 1 В/см. Именно различия в электрофоретической подвижности белков, со-

держащихся в анализируемой смеси, делают возможным разделить эти белки в пространстве (в разных зонах электрофореграммы).

Скорость движения белков к тому или иному электроду снижается из-за их трения в окружающей среде. Сила трения прямо пропорциональна скорости

34

движения белковых молекул. Коэффициент трения белковой молекулы, обо-

значенный как f, зависит как от размера, формы и степени гидратированности этой молекулы, так и от свойств самой среды.

Электрофоретическая подвижность белка зависит:

от самой молекулы: ее размера (молекулярной массы), формы,

электрического заряда, степени диссоциации и гидратации,

от концентрации молекул,

от свойств среды: ее вязкости, рН, температуры и ионной силы,

от характеристик используемого электрического поля (для крупных макромолекул применяется электрофорез в пульсирующем элек-

трическом поле).

Полиакриламидный гель (ПААГ) обладает многими качествами идеаль-

ного носителя. Имея свойства молекулярного сита, он обеспечивает электрофо-

ретическое разделение белковых смесей не только по заряду, но и по размеру и форме частиц. При электрофорезе в ПААГ крупные молекулы, размеры кото-

рых соизмеримы с диаметром пор геля, движутся медленнее, а мелкие молеку-

лы свободно и быстро проходят через поры геля. ПААГ формируют путем со-

полимеризации акриламида, создающего линейную основу, и N,N′-

метиленбисакриламида (BIS), служащего для поперечных «сшивок» линейных цепей.

В результате сополимеризации образуется трехмерная сетка геля. Каж-

дый второй углеродный атом линейной цепи содержит кислотную амидную группу, что обеспечивает гидрофильность полимера. В то же время ПААГ не содержит ионизируемых групп. Для сополимеризации нужны инициаторы и ка-

тализаторы (окислительно-восстановительные системы – источники свободных радикалов). Чаще всего используют систему из двух компонентов:

1. инициатор полимеризации: персульфат аммония (ПСА, PSA), надсер-

нокислый аммоний

2. катализатор образования ПААГ: N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин

(ТЕМЕД, TEMED)

35

Реакция полимеризации полиакриламидного геля:

Меняя концентрацию акриламида от 2 до 50% можно задать определен-

ную пористость геля. Например, диаметр пор в геле, содержащем 7.5% акрила-

мида, равен 5 нм, а 30% акриламида - 2 нм. При выборе концентрации геля учи-

тывают среднюю молекулярную массу (Mr) разделяемых веществ и форму их молекул. Если плотность геля не будет соответствовать молекулярной массе исследуемого белка, то он, либо не войдет в гель, либо будет мигрировать с очень высокой скоростью и, как следствие, выйдет из геля раньше времени.

Также в качестве параметров, влияющих на эффективность разделения, в осо-

бенности белков с приблизительно равной молекулярной массой, можно отме-

тить время проведения электрофореза, длину разгоночной дистанции (чем больше гель, тем выше разрешение), температура процесса (при пониженной температуре белковые зоны меньше размываются за счет диффузии).

36

Выбор концентрации акриламида для оптимального разрешения смеси

белков

Для проведения ПААГ - электрофореза в чаще всего используются бу-

ферная система Лэммли и используют гель, состоящий из двух частей:

Формирующий (концентрирующий) гель имеет pH 6.8 и концентрацию полиакриламида от 2 до 8 %. Крупнопористый гель. Размер его пор ограничи-

вает диффузию, но не обеспечивает гелю свойства молекулярного сита по от-

ношению к большинству разделяемых белков. Этот гель нужен для электрохи-

мического концентрирования белков пробы. Таким образом, концентрирующий гель собирает смесь белков перед переходом в разделяющий гель в одну узкую полосу.

Разделяющий гель имеет рН 8.5 – 9 и концентрацию полиакриламида от 5

до 20 %. Это мелкопористый гель, в котором, собственно, и происходит элек-

трофоретическое и молекулярно-ситовое разделение компонентов пробы.

Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых бел-

ков. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин. При рН 6.8 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. При рН 8.8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследст-

вие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся. В разрешающем геле белки мигрируют в зависимости от длины по-

липептидной цепи, формы, молекулярной массы и т.д.

37

Окрашивание гелей

Для окрашивания белковых зон на ПААГ-электрофореграмме используют несколько универсальных методов. Для этого разделившиеся зоны белков фик-

сируют раствором уксусной кислоты (1 – 10%), смесью уксусной кислоты и этанола и окрашивают, используя раствор красителя. Фиксация предотвращает размывание зон из-за диффузии белковых молекул в геле. Используют такие красители, как амидочерный (амидошварц), кумасси ярко-синий (марок G250, R250), Zn/имидазол, нитрат серебра. Окраска полос происходит пропорцио-

нально количеству белка в зоне. Окраска и количество полос, соответствующих белкам, также зависят от чувствительности того или иного красителя. Так, нит-

рат серебра выявляет зоны с меньшим содержанием белка, чем кумасси.

В настоящее время самым удобным и широко используемым является краситель кумасси ярко-синий, или бриллиантовый синий («Coomassie brilliant blue», G-250, ксилоловый яркий цианин). По сравнению с другими красителями кумасси ярко-синий имеет следующие преимущества:

его чувствительность выше, чем у амидочерного, и в боль-

шинстве случаев вполне подходит исследователям,

- зависимость интенсивности окраски от концентрации белка остается линейной в более широком диапазоне концентраций,

кумасси значительно дешевле и проще в использовании, чем нитрат серебра и не требует особо чистой дистиллированной воды, как

Zn/имидазол

в отличие от гелей, окрашенных Zn/имидазолом, гели при ис-

пользовании кумасси можно хранить (либо высушить, либо поместить в

5%-ную уксусную кислоту, где существенного снижения интенсивности окраски полос не произойдет в течение 8-11 недель).

К недостаткам метода относится более низкая чувствительность, а также длительность процедуры отмывки геля от избытка связавшегося красителя.

Также кумасси G250 используется для фотометрического определения концен-

трации белков по методу Бредфорд.

38

ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях

В случае, когда требуется фракционировать белки исключительно по мо-

лекулярной массе, применяют ПААГ-электрофорез в денатурирующих услови-

ях. Для этого перед нанесением на гель образцы кипятят в присутствии доде-

цилсульфата натрия (ДСН, SDS) и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-

меркаптоэтанола происходит восстановление дисульфидных связей, что повы-

шает подвижность полипептидов. SDS является сильным детергентом, его мо-

лекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфат-иона, имеющего в растворе отрицатель-

ный заряд.

При использовании данного метода исходят из следующих допущений:

белки после обработки SDS находятся в полностью денатурирован-

ном состоянии;

количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорцио-

нально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;

собственный заряд полипептида несущественен по сравнению с суммарным отрицательным зарядом связанных с ним молекул SDS;

все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются

обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы.

При более реалистичном рассмотрении вопроса, эффективность разделе-

ния зависит не от молекулярной массы белка, а от его молекулярного радиуса,

так называемого радиуса Стокса.

39