Техника CRISPR–Cas9 / Техника CRISPR–Cas9
.docx
Техника CRISPR–Cas9
Вопрос об изменении генома живых организмов, и, как следствие, изменение их фенотипических свойств, появился после прорывных работ в области фундаментального понимания биологической наследственности. Одним из важнейших результатов этих работ стало открытие в 1953 году Фрэнсисом Криком (Francis Crick) и Джеймсом Уотсоном (James Watson) структуры ДНК. Ещё до их работ были подозрения и даже целые гипотезы о том, что молекулы этого вещества (ДНК) связаны с передачей генетической информации от одного организма к другому при их размножении, например, к тому моменту уже было известно, что ДНК кодируют белки. Открытая структура дала толчок к всестороннему изучению микробиологических принципов и механизмов наследования генетической информации.
Вскоре появились первые работы по целенаправленному изменению молекул ДНК, что положило начало генной инженерии. Сегодня генная инженерия представляет из себя область науки и технологий, занимающуюся изменением и манипулированием генами организма с целью изменения его генетического состава. Это приводит к получению новых организмов с изменёнными качествами. Стоит отметить, что люди уже умели получать живых организмов с необходимыми свойствами с помощью селекционного разведения. Но селекция не является методом генной инженерии, поскольку она берет ген непосредственно из одного организма и передаёт его другому, поэтому генную инженерию также называют генетической модификацией или генетической манипуляцией, а селекция получает организмов с желаемым фенотипом путём многократного скрещивания организмов и последующим отбором желаемых особей.
Также генная инженерия не включает в себя оплодотворение in vitro (так называемое ЭКО), индукцию полиплоидии, мутагенез и методы слияния клеток, которые не используют рекомбинантные нуклеиновые кислоты или генетически модифицированный организм в процессе.
Что же в таком случае относится к методам генной инженерии. Существует четыре основные группы методов. Для начала, чтобы с ДНК можно было работать их сначала нужно от куда-нибудь взять. Самым подходящим таким местом является клетки живых организмов, потому к первой группе методом генной инженерии можно отнести экстракцию или выделение ДНК. После выделения молекул ДНК нужно выделить молекулу или молекулы, отвечающие за необходимый ген или гены. Поэтому следующей группой будут методы изоляции ДНК. После того, как необходимые цепочки нуклеотидов получены, можно заниматься их редактированием – третья группа – методы модификации или редактирования ДНК. После редактирования полученные гены необходимо встроить в геном целевого организма, поэтому четвёртой группой будут методы доставки, введения или вставки редактированных генов.
Из этих четырёх групп техника CRISPR–Cas9 относится к третьей, поскольку нацелена на редактирование непосредственно генома. Как же была создана и как работает данная технология.
Всё началось в конце 80-х годов, когда группа японских учёных смогла частичность секвенировать, то есть расшифровать геном кишечной палочки. В результате они обнаружили, что участок ДНК, которые ничего не кодировал и к тому же он состоял из повторяющихся последовательностей нуклеотидов, разделённых различными участками, которые прозвали спейсерами (англ. spacer). Впоследствии такие странные участки, состоящие из не кодирующих последовательностей и спейсеров, найдут у многих бактерий и архей, и назовут кассетами или CRISPR (англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) (читается на англ. как crisper, а на рус. – криспер).
В начале 2000-х было обнаружено, что такие последовательности спейсеров часто совпадали или были похожими на геномы вирусов. Тогда же были обнаружены гены, кодирующие белок, называемый Cas (англ. CRISPR-associated sequence – последовательность, ассоциированная с CRISPR) и часто располагающиеся вместе с CRISPR. Выдвигались предположения от том, что CRISPR и Cas как-то связаны с иммунной системой бактерий. Даже была предложена детальная гипотетическая схема механизма действия CRISPR и белка Cas так называемая CRISPR/Cas-система. И уже в 2007 была выпущена статья в журнале Science, в которой окончательна была подтверждена гипотеза об иммунной функции CRISPR/Cas-систем.
Технология CRISPR/Cas9 устроена следующим образом. В CRISPR, в его спейсерах хранятся последовательности вирусных ДНК. Когда в клетку попадает вирусное ДНК белок Cas9 связывает с собой (прикрепляет к себе) синтезированную РНК-копию CRISPR клетки. Связавшись, он перемещается к вирусному ДНК. Добравшись до него белок развёртывает ДНК вируса и начинает сравнивать его последовательность с последовательность РНК-копии CRISPR клетки. Как только было найдено полное соответствие белок разрезает вирусную ДНК и запускает цепь реакций, в результате вся ДНК уничтожается.
Этот механизм можно использовать для редактирования генома следующим образом. Если нам надо сделать разрез в нужных местах целевого ДНК мы можем создать искусственную CRISPR-кассету методами химического синтезирования, при этом место спейсера занимает последовательность, выбранная исследователем. Белок Cas9 может «узнать» и связаться с такой синтетической РНК-копией, которую теперь называют РНК-гидом искусственной CRISPR. После этого белок становится запрограммированным на узнавание и разрезание соответствующего ей места в целевой ДНК.
Полученную CRISPR/Cas-систему уже можно применять для редактирования генома. Например, человек болен гемофилией (несвертываемость крови). Гемофилия, как и большинство генетических болезней, вызвана изменением только одной буквы ДНК. С помощью CRISPR/Cas9 мы можем найти только одну «опечатку» и исправить её в заданном месте, не изменив ничего больше. С помощью гида РНК, последовательность которой совпадает с искомым местом, он может внести разрыв в нужное место генома. После разрыва клетка не умрёт, так как он будет исправлен по здоровой копии из парной хромосомы за счёт естественного процесса так называемой репарации ДНК. Но можно и не задействовать механизм репарации, а встроить свою последовательность нуклеотидов в вырезанный участок используя специальную матричную РНК.
С помощью CRISPR/Cas9 можно делать мультиплексное редактирование сразу нескольких неправильных генов. Для этого достаточно ввести белок Cas9 и несколько разных РНК-гидов. Каждый из них направит Cas9 к собственной мишени, и вместе они устранят генетическую проблему.
Весь этот механизм редактирования работает благодаря принципу комплементарности, который заключается в том, что каждое азотистое основание: аденин (A), гуанин (G), цитозин (C), тимин (T) для ДНК и урацил (U) для РНК может образовать связь при образовании ДНК только с тем основанием, которое будет ему комплементарно. Так аденин комплементарен тимину в случае ДНК, а также комплементарен урацилу в случае РНК; гуанин комплементарен цитозину. Именно благодаря этому принципу белок Cas9 сравнивает участки РНК и целевой ДНК, при этом образуется необычная структура, содержащая двуцепочечный участок взаимокомплементарных РНК и одной из цепей ДНК-мишени, а другая цепь ДНК оказывается «вытесненной».
Что касается лечения генетических заболеваний, то с помощью CRISPR/Cas9 мы сможем лечить «простые», моногенные генетические заболевания: гемофилию, муковисцидоз, лейкемию. В этих случаях понятно, что именно нужно отредактировать, но существуют заболевания с высокой наследуемостью, генетическая природа которых очень сложна. Например, многие учёные ищут гены шизофрении и алкоголизма, каждый год находят новые, каждый год часть ранее отрытых генов оказывается ни при чем. Как лечить такие сложные болезни с помощью CRISPR/Cas9 – непонятно, и, очевидно, потребуются комплексные подходы.