pdf.php@id=6179

Процесс фосфорилирования, сопряженный с тканевым дыханием, называется окислительным фосфорилированием. Чрезвычайно важнойфункциейцепидыхательныхферментовмитохондрийнаряду с передачей электронов является аккумуляция части освобождающейсяэнергиивфосфатныхсвязяхмакроэргическихсоединений.

Обмен энергии в организме тесно связан с обменом веществ. Аэробные организмы, к которым относятся млекопитающие, получают большую часть энергии за счет биологического окисления, при котором во время катаболизма электроны переносятся с органических молекул на молекулу кислорода. Этот перенос осуществляется дыхательной цепью (электронтранспортной цепью (ЭТЦ)), состоящей из белковых комплексов, находящихся во внутренней мембране митохондрий и содержащих реакционные центры. Более половины свободной энергии электронов расходуется на синтез АТФ. АТФ служит источником энергии для протекания большого количества химических реакций. Основными субстратами (донорами электронов) для митохондриальной дыхательной цепи являются компоненты общего пути катаболизма (пируват, изоцитрат, малат, сукцинат, α-кетоглутарат). В этот путь включаются все метаболиты белкового, углеводного и липидного обмена.

Углеводы в организме человека играют важную роль и выполняют разнообразные функции. Наиболее важная из них – энергетическая, поскольку 60–70 % всей энергии, которая используется организмом для нормальной жизнедеятельности, производится из углеводов. Основным источником энергии является окисление гликогена и глюкозы в тканях.

Лабораторная работа № 15 Использование неорганического фосфата в процессе спиртового брожения

Цель работы – познакомиться с процессом спиртового брожения и оценить изменение концентрации неорганического фосфата в этом процессе.

81

Теоретические сведения Спиртовое брожение глюкозы протекает в анаэробных ус-

ловиях под влиянием ферментов дрожжей.

Метод основан на качественном определении неорганического фосфата, концентрация которого уменьшается за счет использования его на образование 1,3-дифосфоглицерата в процессе гликолиза.

Исследуемый материал: дрожжи. Реактивы:

1)10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;

2)глюкоза;

3)основной фосфатный буфер (растворяют 33,5 г NaOH в 400 мл воды в мерной колбе вместимостью 500 мл и добавляют

226,8 г KH2PO4, встряхивают до полного растворения, охлаждают и доливают водой до метки);

4)2,5%-ный раствор молибдата аммония в серной кислоте

(2,5 г молибдата аммония растворяют в 60 мл дистиллированной воды, фильтруют; раствор вносят в колбу на 100 мл; в другой колбе к 25 мл дистиллированной воды приливают 7,5 мл концентрированной серной кислоты; второй раствор приливают к первому, охлаждают и доводят дистиллированной водой до метки; раствор стабилен не менее месяца);

5)0,5%-ный раствор аскорбиновой кислоты.

Оборудование:

1)штатив с пробирками;

2)ступка с пестиком;

3)химический стаканчик;

4)термостат или водяная баня на 37–38 оС;

5)воронки с фильтрами.

Ход работы Заготавливают 4 пронумерованные пробирки и наливают в

каждую по 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты.

82

Вфарфоровой ступке растирают 1 г сухих дрожжей, 1 г глюкозы, добавляют по каплям 5 мл дистиллированной воды, 5 мл фосфатного буфера и перемешивают. До начала брожения 1 мл смеси переносят в 1-ю пробирку с трихлоруксусной кислотой. Трихлоруксусная кислота осаждает белки и ферменты и тем самым прекращает брожение.

Оставшуюся смесь переносят в стаканчик и помещают в термостат при температуре 37–38 оС на 1,5 ч. Через каждые полчаса отбирают из стаканчика по 1 мл бродильной смеси и переносят в заготовленные пробирки с трихлоруксусной кислотой. Спустя 5 мин после взятия каждой пробы содержимое пробирки фильтруют через складчатые фильтры в четыре пронумерованные пробирки и получают безбелковые фильтраты. Когда будет получен последний фильтрат, со всеми пробирками проделывают молибденовую реакцию на фосфорную кислоту, в результате которой образуется комплексное соедине-

ние фосфомолибдат аммония (NH4)3PO4·12MoO3, которое, в свою очередь, при добавлении аскорбиновой кислоты восстанавливается с образованием молибденовой сини (смеси различных окислов молибдена).

Вкаждую пробирку с безбелковым фильтратом добавляют по 1 мл 2,5%-ного раствора молибдата аммония в серной кислоте и по 0,5 мл 0,5%-ного раствора аскорбиновой кислоты, перемешивают и оставляют на 15 мин. Затем в каждую пробирку добавляют по 8 мл дистиллированной воды и перемешивают.

Интенсивность синей окраски уменьшается от первой пробирки к последней, что связано с уменьшением неорганического фосфата в процессе брожения.

Указания к составлению отчета Написать реакцию спиртового брожения, в которой расхо-

дуется неорганический фосфат.

83

Лабораторная работа № 16 Количественное определение неорганического фосфора в культуральной жидкости

Цель работы – ознакомиться с колориметрическим методом определения содержания неорганического фосфора в культуральной жидкости.

Теоретические сведения Неорганический фосфор биологических жидкостей входит в

состав солей фосфорной кислоты. Основное назначение солей фосфорной кислоты в биологических жидкостях – создание в них буферной системы. Неорганический фосфат реагирует с молибдатом аммония в присутствии восстановителей (например, аскорбиновой кислоты) с образованием окрашенного комплексного соединения (молибденовой сини). Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации неорганического фосфата.

Исследуемые материалы: культуральная жидкость. Реактивы:

1)10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;

2)молибденовый реактив (см. работу № 15);

3)1%-ный раствор аскорбиновой кислоты на 0,1 М растворе соляной кислоты;

4)дигидрофосфат калия (навеску 0,4394 г KН2РО4, предварительно высушенного в эксикаторе над серной кислотой, взвешивают на аналитических весах и растворяют в колбе вместимостью 100 мл; затем этот раствор разводят в 100 раз и используют для построения калибровочного графика).

Оборудование:

1)фотоэлектроколориметр (ФЭК);

2)центрифуга;

3)центрифужные пробирки;

4)штатив с пробирками;

5)пипетки.

84

Ход работы

1. Построение калибровочного графика

Впять пробирок вносят по 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 и 1,0 мл раство-

ра KН2РО4 и по 0,9; 0,8; 0,6; 0,4 и 0,0 мл воды соответственно. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл трихлоруксусной кислоты, по 1,0 мл молибденового реактива и по 1,0 мл раствора аскорбиновой кислоты. Через 10 мин измеряют экстинкцию калибровочных проб на ФЭК при длине волны 630–690 нм в кювете с толщиной слоя 0,5 см против контрольной пробы (1,0 мл воды, 0,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, 1,0 мл молибденового реактива и 1,0 мл раствора аскорбиновой кислоты).

По оси ординат откладывают значения экстинкции (Е), а по оси абсцисс – содержание неорганического фосфата в пробе: 0,001, 0,002, 0,004, 0,006 и 0,010 мг соответственно от первой к пятой пробирке.

2.Определение содержания фосфора в культуральной жидкости

Вцентрифужную пробирку вносят 1,8 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 0,2 мл культуральной жидкости, смесь перемешивают и оставляют на 10 мин (для осаждения белков). Затем пробу центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. Отбирают 1,5 мл надосадочной жидкости в другую пробирку и приливают 1,0 мл молибденового реактива и 1,0 мл раствора аскорбиновой кислоты. Через 10 мин измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной пробы.

Указания к составлению отчета Заполнить табл. 8 и на основании ее построить калибро-

вочный график.

85

Концентрацию фосфора (в форме неорганического фосфата) в пробе (мкг/мл) определить по калибровочному графику.

Лабораторная работа № 17 Ортотолуидиновый метод определения содержания глюкозы в культуральной жидкости

Цель работы – сформировать навыки количественного определенияглюкозыкакосновногометаболитауглеводногообмена.

Теоретические сведения Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе ук-

сусной кислоты дает сине-зеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на фотоэлектроколориметре.

Исследуемые материалы: культуральная жидкость. Реактивы:

1)3%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;

2)ортотолуидиновый реактив (0,15 г тиомочевины растворяют в 94 мл ледяной уксусной кислоты и смешивают с 6 мл перегнанного ортотолуидина; хранят в темной склянке);

3)стандартный 0,1%-ный раствор глюкозы.

Оборудование:

1)фотоэлектроколориметр;

2)центрифуга, центрифужные пробирки;

3)штатив с пробирками;

4)водяная баня;

5)пипетки.

Ход работы

1. Осаждение белков

В две центрифужные пробирки наливают по 0,9 мл 3%- ного раствора трихлоруксусной кислоты, затем в одну из них

86

вносят 0,1 мл культуральной жидкости, а в другую 0,1 мл стандартного раствора глюкозы. Содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

2. Цветная реакция с ортотолуидиновым реактивом

В обычные сухие пробирки вносят 0,5 мл надосадочной жидкости из каждой пробирки, добавляют по 4,5 мл ортотолуидинового реактива и помещают в кипящую водяную баню (100 оС) на 8 мин (время инкубации проб и температурный режим необходимо соблюдать точно, кроме того, обязательным условием для нормального протекания данной реакции является непрерывное кипение воды в бане). По истечении времени пробирки вынимают и охлаждают в водопроводной воде до комнатной температуры.

3. Измерение оптической плотности растворов

Оптическую плотность проб измеряют на фотоэлектроколориметре в кюветах на 10 мм против воды с красным светофильтром (длина волны 620 нм).

Указания к составлению отчета Содержание глюкозы в опытной пробе рассчитывают по

стандартному раствору глюкозы по формуле

Соп = (Сст . Еоп) / Ест,

где Cоп – концентрация глюкозы в опытной пробе, ммоль/л; Cст – концентрация глюкозы в стандартной пробе, 5,55 ммоль/л; Еоп – оптическая плотность исследуемой пробы; Ест – оптическая плотность стандартного раствора глюкозы.

Лабораторная работа № 18 Качественные реакции на некоторые составные части молока

Цель работы – изучить качественный состав молока и научиться приемам определения физико-химических показателей молока.

87

Задачей данной работы является с помощью качественных реакций доказать, что в состав молока входят белки (казеин, альбумин и глобулин), углеводы (лактоза) и другие компоненты; определить, какие соединения появляются в кислом молоке; проанализировать полученные результаты и сделать выводы.

Теоретические сведения Молоко представляет собой секрет молочных желез. В его

состав входит около 200 различных веществ, которые можно разделить на пять основных групп: вода, белки, липиды, углеводы и минеральные соли. Химический состав молока зависит от вида животного, породы, возраста самки, периода лактации, условий кормления и других факторов.

Вода. На долю воды в составе молока может приходиться от 67,7 % (олень) до 90,3 % (лошадь). В коровьем молоке в среднем содержится около 88,0 % воды. Она может находиться в свободном и связанном состояниях. Свободная вода легко удаляется при сгущении, высушивании и других обработках, связанная входит в состав сольватных оболочек коллоидов.

Белки. Содержание белков в молоке различных животных варьирует от 0,9 % (олень) до 5,1 % (овца), в коровьем молоке оно составляет 2,9–4,0 %. В обезжиренном молоке 45–55 % белков составляет α-казеин. Его молекулярная масса 19–100 тыс. В молоке он образует казеинат-кальций-фосфатный комплекс, участвующий в формировании оболочки жировых шариков.

α-Лактоальбумин имеет молекулярную массу 14437, устойчив к нагреванию, участвует в биосинтезе лактозы из галактозы и глюкозы. β-Лактоальбумин имеет молекулярную массу 36 тыс., денатурирует при рН = 7 и нагревании до 70 оС; его кристаллы не растворяются в воде и растворяются в разбавленных растворах солей.

Глобулины молока имеют высокую молекулярную массу (от 150 тыс. до 1 млн), обладают свойствами липооксида, их молекула содержит углеводный компонент.

88

Протеино-пептонную фракцию представляют простые белки, связанные с углеводными компонентами: гексозами, сиаловыми кислотами и гексозаминами. Фракция содержится в сыворотке молока (образуется после осаждения казеина) и мицеллах.

Кроме этого, в молоке имеются и другие белки: ферменты всех шести классов, красный протеин, лактолин и др.

Небелковые азотистые вещества. Их содержание достига-

ет 0,021–0,036 %; состоят из мочевины (более половины), аминокислот, пуриновых оснований, креатина и других веществ.

Углеводы. На долю углеводов у разных животных приходится от 2,8 % (олень) до 6,5 % (лошадь), в коровьем молоке они составляют около 4,9 %. Углеводы находятся в свободной и связанной с белками формах. Свободные углеводы представлены лактозой (в среднем 4,7 %), галактозой, глюкозой, фосфорными эфирами моноз, аминосахарами. Связанные углеводы составляют 0,3 % молока. Это моносахариды, гексозамины, сиаловые кислоты, лактоза. Больше всего лактозы содержится в молоке носорога (до 36 % от общей массы).

Липиды. В молоке они представляют собой смесь нейтрального жира, стеринов, стеридов, фосфатидов, гликолипидов и их производных. Содержание их в молоке животных различных видов неодинаково: наибольшее количество (17,1 %) отмечено у оленя, минимальное – у лошади (всего 1,0 %), в коровьем молоке в среднем 4,9 %.

Основу липидов молока составляют триглицериды (98–99 % от общей массы), в составе которых чаще всего обнаруживаются остатки пальмитиновой, олеиновой, стеариновой и миристиновой кислот (всего 60–64 жирные кислоты с углеродной цепью от С4 до С26). Общее содержание ненасыщенных жирных кислот в липидной фракции молока достигает летом 35–42 % и зимой 25–34 %. Холестерина в молоке содержится 0,012–0,013 %. Стерины и стеридыконцентрируютсявоболочкахжировыхшариков.

Витамины. Коровье молоко содержит витамины, мг/100 г:

В1 – 0,04; В2 – 0,15; РР – 0,1; С – 1,5; А – 0,25; D – 0,05·10-3;

89

Е – 0,09. Для обогащения молока животным дают корма, богатые витаминами, вводят концентраты витаминов А и D или Е. Молоко может быть обогащено витаминами также биологическим путем – при введении микробов, синтезирующих определенные витамины. Так, внесение в молоко штаммов молочно-кислых бактерий дает возможность повысить в простокваше и кефире содержание вита-

минаC в2–4, РРв5–10, В12 в20–50, В2 в1,5–2 раза.

Пигменты. Молоко содержит каротины, лактофлавин, небольшоеколичествохлорофиллов. Отнихзависитокраскамолока.

Минеральные вещества. Их содержание в молоке составляет 0,7–1 %, они находятся в свободном и связанном состояниях. Молоко коровы содержит хлориды, фосфаты, цитраты, гидрокарбонат натрия, сульфат натрия. Молоко богато кальцием (11,2–12,8 мг), 78 % которого находится в фосфатах и цитратах, 22 % связано с казеином. Кроме этого, молоко содержит многие микроэлементы (Fe, Cu, Zn, Mn). Минеральные вещества находятся в молоке в виде солей, кислот, ионов, биокомплексов, входят в состав металлоэнзимов и др.

Исследуемые материалы: молоко свежее и кислое по 0,5 л. Реактивы:

1)10%-ный раствор уксусной кислоты;

2)универсальная индикаторная бумага;

3)10%-ный раствор аммиака;

4)10%-ный раствор едкого натра;

5)5%-ный раствор сульфата меди;

6)1%-ный раствор сульфата меди;

7)порошок серно-кислого магния;

8)раствор молибдата аммония (см. работу № 15);

9)раствор щавелево-кислого аммония(1,654 г(NH4)C2O4·H2O растворитьвводевмернойколбена250 мл);

10)реактив Уфельмана (к 2–3 мл 2%-ного раствора фенола прибавляют 4–5 капель 1%-ного раствора FeCl3);

11)68–70%-ный этиловый спирт;

12)0,9%-ный раствор хлорида натрия.

90