книги / Основы взаимодействия физических полей с биологическими объектами. Воздействие ионизирующего и оптического излучения
.pdfстояния в основное (см. В2). Такой переход, как правило, является термодинамически неравновесным. Люминесценция делится на хемилюминесценцию, флуоресценцию, фосфоресценцию и др.
Напомним, что хемилюминесценция обусловлена преобразо ванием энергии химических процессов в излучение. В данном слу чае нас интересует биолюминесценция, т. е. разновидность хеми люминесценции, представляющая собой те виды люминесценции живых тканей, которые не связаны с воздействием на них какойлибо внешней энергии излучения.
Биолюминесценция обусловлена определенными химическими процессами, протекающими в живых клетках, и, к примеру, сопровождает образование свободных радикалов. Биолюминесцентные тесты используются в качестве индикаторов определен ных биохимических реакций. Биолюминесцентное излучение мо жет захватывать как ультрафиолетовую, так и видимую область спектра.
В природе преобладает биолюминесценция желто-зеленой об ласти, отчетливо выраженная у микроорганизмов, беспозвоноч ных, глубоководных рыб. Теплокровные обладают весьма слабой по сравнению с другими представителями флоры и фауны биолю минесценцией. Этот факт является источником диагностической информации (увеличение фона биолюминесценции тканей означа ет наличие патологии). Для количественного анализа биолюми несценции необходимы чувствительные приборы, способные из мерять интенсивность излучения на уровне отдельных квантов. Видимый свет подавляет биолюминесценцию клеток, что было изучено еще С.И. Вавиловым, высказавшим ряд весьма плодо творных идей касательно изучения люминесценции.
Флуоресценция и фосфоресценция представляют собой переизлучение предварительно поглощенного света (см. В2). Они обу словлены переходами внешних валентных электронов. Именно эти электроны ответственны за химические связи, поэтому люминес центный анализ исключительно информативен при изучении ди намики молекулярных структур.
Временной диапазон между поглощением излучения и его по следующим испусканием достаточен для протекания целого ряда процессов, каждый из которых ведет к изменению наблюдаемой характеристики флуоресценции. К таким процессам относятся: столкновения с молекулами тушителя флуоресценции (например,
О2), вращательная и поступательная диффузия, образование ком плексов с растворителем или растворенными веществами и т. д.
101
Основные параметры флуоресценции [9].
1. Интенсивность флуоресценции - число излучаемых фотонов dN^n в полосе dXфл на длине волны А,фл при данной интенсив
ности возбуждения:
^фл — ^ ^ ф л •
2. Спектр возбуждения - зависимость интенсивности флуорес ценции /фл на длине волны Хфл от длины волны возбуждающего
излучения А.в :
^фл (^в ) —^^ф л ^ |
» ^фл —^OnSt. |
Спектр возбуждения подобен спектру поглощения и его изучение позволяет ответить на вопрос, какая длина волны возбуждения Хв
вызывает наиболее интенсивную флуоресценцию, а также, если в растворе находится набор флуоресцирующих молекул, какому именно флуорофору отвечает данная А.фл.
3. Спектр флуоресценции - зависимость интенсивности флуо ресценции /фл при данной длине волны возбуждения Хв от длины
волны флуоресценции Хфп:
/фл (^в) “ dN*n f ^^фл> “ const,
т. е. распределение интенсивности излучаемого света по частотам (длинам волн).
Согласно правилу Стокса, максимум в спектре люминесценции всегда сдвинут в сторону длинных волн по отношению к спектру поглощения, порождающему люминесценцию. Это легко объяс нить, придерживаясь приближения Борна - Оппенгеймера (см. В2). Запишем полную энергию молекулы:
£ ~ ^эл + ^кол + ^вр •
Она представляет собой сумму энергии движения электронов в разрешенных состояниях, энергии колебаний атомов в молекуле и энергии вращения молекулы как целого. Спектры люминесценции определяются только электронной составляющей полной энергии, тогда как поглощенная энергия распределяется между всеми тремя составляющими.
В принципе, знание спектров поглощения и люминесценции позволяет полностью описать процесс, но на практике эта задача
102
очень трудно разрешима. Как уже указывалось, люминесценция биообъектов обладает очень слабой интенсивностью. Для измере ния эмиссионного спектра требуется аппаратура с чувствительно стью на уровне счета отдельных квантов. Казалось бы, несколько лучше обстоит дело со спектром поглощения - для просвечивания образца можно использовать достаточно мощный источник света, и на пределе чувствительности работать необязательно. Однако, как только интенсивность падающего света возрастает, начинает проявляться нелинейность биосреды, поскольку коэффициент по глощения существенно зависит от интенсивности. В результате измеряется вовсе не тот спектр, который требуется. Эксперимен таторы давно сумели преодолеть эту трудность с помощью опре деления спектра возбуждения. При этом нелинейность спектра поглощения исключается из рассмотрения вследствие того, что измеряется интегральная интенсивность, которая достаточно ве лика и, что особенно важно, не требует установления характера спектральной зависимости испускания. В то же время длину вол ны зондирующего излучения можно задавать с высокой точно стью, и тогда спектр возбуждения получается идентичным спектру поглощения, но без нелинейных особенностей.
4. Квантовый выход флуоресценции т)фл- отношение числа
излучаемых за секунду квантов 7Уфл к числу поглощенных за се
кунду квантовNu:
Лфл - Л ^ п .
Согласно закону Вавилова, квантовый выход люминесценции по стоянен и не зависит от того, светом какой длины волны облучает ся молекула. Квантовый выход флуоресценции меняется при на личии тушителей флуоресценции, олигомеризации и т. д.
5. Время жизни (затухания) х флуоресценции - время, в течение которого интенсивность флуоресценции уменьшается до уровня Me начального значения; связь между интенсивностью флуоресценции /фл и временем жизни т определяется выражением
^фл = АфпО^ у
где /фл0 - максимальная интенсивность флуоресценции во время
возбуждения. Время жизни флуоресценции зависит от типа рас творителя (окружающих молекул), от связи с другими молекула ми, олигомеризации, изменения конформации молекул и т. д.
103
Основываясь на принципах расчета молекулярных спектров по Борну - Оппенгеймеру, можно вычислить собственное излуча тельное время жизни возбужденного состояния, которое для флуоресценции составляет
1 |
3,5 -108 |
т0 |
(3.4) |
|
v max J n ( v ) ^ v *
где vmax - средняя частота полосы поглощения; p(v) - частотная
зависимость коэффициента экстинкции. Величина 'т 0 представ
ляет собой время жизни возбужденного состояния в отсутствие других путей потери энергии возбуждения (см. рис. 3.5). Если по лоса поглощения симметрична, то (3.4) можно упростить:
1 |
3,5 -108 |
(3.5) |
т0 |
v maxMmax^V|/2 |
|
|
|
|
Здесь |imaxкоэффициент экстинкции в максимуме полосы |
по |
глощения; AVJ/2 ~ ширина полосы на половине высоты. Таким образом, можно рассчитать излучательное время жизни возбуж денного состояния из спектроскопических данных. Флуоресцен ция является относительно быстрым процессом, поскольку излу чательный переход разрешен: обычно Чо = 10_6... КГ9 с. Это
время велико по сравнению с единичным актом первичного по глощения (10-15с), но в то же время оно мало по сравнению со временем распада возбужденного состояния при биолюминесцен ции и фосфоресценции. Отметим также, что вычисляемое таким образом время флуоресценции больше, чем экспериментально оп ределяемое, поскольку фактическое время 1т0 представляет собой величину, обратную сумме всех констант скоростей процессов распада возбужденного состояния.
Излучательное время жизни фосфоресценции
3 |
3,5-Ю8 |
g 3 |
|
vmaxJV(v)^V |
(3.6) |
|
g] ’ |
где g3 и g\ - факторы вырождения триплетного и синглетного со стояний соответственно. Такие запрещенные переходы (см. В2)
104
имеют малые коэффициенты экстинкции, и поэтому время жизни,
о
вычисленное из (3.6), оказывается большим (от 10 с до несколь ких минут и даже часов). Это эквивалентно утверждению, что со стояние, которое трудно заселить путем непосредственного воз буждения, также трудно распадается в результате излучательного процесса. По этой причине триплетные состояния играют преоб ладающую роль в фотохимии биомолекул, поскольку при прочих равных условиях они живут гораздо дольше синглетных и имеют более высокую вероятность вступить в фотохимическую реакцию. Этот факт усугубляется еще и тем обстоятельством, что в три плетном состоянии внешние электроны не спарены.
6. Степень поляризации Р и степень анизотропии г флуорес ценции - распределение электромагнитных колебаний относи тельно направления наблюдения.
Степень поляризации флуоресценции Р - это доля поляризо ванного света в общей суммарной интенсивности флуоресценции (см. В2). За время жизни т возбужденного состояния молекула ус певает повернуться, происходит деполяризация излучения по сравнению с поглощенным квантом. Деполяризация тем больше, чем быстрее поворачивается молекула, т. е. чем меньше вязкость ее окружения. Поэтому поляризацию флуоресценции определяют, чтобы, например, изучить микровязкость структуры клетки.
Согласно формуле Перрена - Яблонского,
\/P - 1 /3 = (1/PQ -1/3)(1 + RTT /V T]\
где Р0 - максимальная степень поляризации; т - время жизни флуоресценции; V - объем моля флуоресцирующих молекул; г\ - вязкость среды.
Поляризация флуоресценции несет информацию о молекуляр ной организации биообъектов и патологических изменениях в тка нях, клетках и субклеточных структурах.
Анизотропное световое возбуждение позволяет выделить из хаотической группы атомов или молекул определенную группу.
Многие важные биологические объекты характеризуются соб ственной флуоресценцией или имеют флуоресцирующие компо- ненты-флуорофоры. Собственную флуоресценцию не следует пу тать с биолюминесценцией. Напомним, что биолюминесценция есть процесс преобразования энергии химических реакций, в ко торых участвуют биомолекулы, в энергию электромагнитного из лучения. Поглощение при биолюминесценции отсутствует. Собст
105
венная люминесценция есть процесс высвечивания биотканями предварительно поглощенной энергии электромагнитного излуче ния в виде электромагнитного же излучения.
Например, около 90 % флуоресценции белков обусловлено на личием в них ароматической аминокислоты триптофана, осталь ная часть приходится на тирозин, фенилаланин, цестеин и цистин. Квантовый выход УФ-флуоресценции живой клетки составляет
1...4 |
%. При этом длины волн |
ки = 275...280 нм, Хфл = |
= 300 |
...350 нм и время жизни т = 1 |
...7 нс зависят от типа белка и |
третичной структуры. Спектры поглощения и испускания трипто фана, тирозина и фенилаланина изображены на рис. 3.7.
Рис. 3.7. Спектры поглощения (а) и флуоресценции (б) триптофана (/), тирозина (2) и фенилаланина (3)
Спектр поглощения триптофана определяется его индольным кольцом. Этой аминокислоте присущи две полосы поглощения: первая с максимумом в области 218 нм, вторая (преобладающая) - в области 280 нм. Даже малое содержание триптофана в белке существенно влияет на характер его спектров, так как молярный коэффициент поглощения этой аминокислоты в 4 раза больше, чем тирозина, и почти в 30 раз больше, чем фенилаланина. При возбуждении молекул раствора триптофана ультрафиолетом с к < 300 нм возникает его флуоресценция, максимум которой при ходится на к * 350 нм. Квантовый выход флуоресценции трипто фана в нейтральном водном растворе при комнатной температуре достигает 0,2.
Спектр поглощения тирозина обусловлен его фенольным коль цом. Максимумы в спектре поглощения приходятся на 222 и
106
275 нм. В нейтральном водном растворе при комнатной тем пературе максимум флуоресценции тирозина приходится на 303. ..304 нм, квантовый выход равен 0,21.
Спектры поглощения и флуоресценции фенилаланина связаны с наличием бензольного кольца. Максимум в спектре поглощения приходится на 257 нм, квантовый выход невелик - 0,038-0,045.
Если белок содержит все три аминокислоты, то в суммарном спектре флуоресценции преобладает триптофановая люминесцен ция. При отсутствии триптофана спектры флуоресценции белко вой молекулы и тирозина практически совпадают. Свечение фени лаланина проявляется только при отсутствии других аромати ческих аминокислот. Таким образом, анализ спектров флуорес ценции белка дает возможность прецизионного распознавания его состава. В клетках человека содержится много белков, в состав которых входят перечисленные аминокислоты. Это актин, миозин, тропонин, ферменты типа дегидрогеназы, фосфатазы, оксидазы, некоторые гормоны (АКТГ, СТГ, тиреоглобулин и др), пищевари тельные ферменты (пепсин, трипсин, химотрипсин), альбумины и глобулины плазмы крови и ряд других веществ. Собственная ультрафиолетовая флуоресценция этих белков определяется глав ным образом триптофаном, причем их спектры излучения сдвину ты в сторону коротких волн на 10...25 нм относительно спектров люминесценции водного раствора триптофана. Спектры белков, содержащих тирозин и фенилаланин в отсутствие триптофана и люминесцирующих практически так же, как и тирозин, свойствен ны РНКазе*, гистонам, коллагену, тропомиозину, инсулину и ряду других веществ. Их максимум практически совпадает с максиму мом флуоресценции водного раствора тирозина (X = 304 нм). Квантовый выход здесь мал (не выше 0,1, чаще 0,04-0,05).
Флуоресцируют также восстановленные пиридин-нуклеотиды
НАД-Н и НАДф” -Н2 (Хфл = 440...480 нм) и окисленные флаво-
протеины (ФП) (Хфл = 510...540 нм), которые участвуют во внут риклеточных процессах: гликолиз, цикл Кребса, дыхание. Поэтому при флуоресцентном анализе могут быть выявлены любые сдвиги в клеточном метаболизме, отражающиеся на динамике свойств НАД-Н и ФП.
’ РНК - рибонуклеиновая кислота.
"" НАД - никотинамидадениндинуклеотид, НАДФ - никотинамидаденинди- нуклеотид-фосфат.
107
Собственной флуоресценцией в УФ-диапазоне обладают со кратительный аппарат клетки, митохондрии и некоторые другие клеточные структуры, причем ее интенсивность зависит от физио логического состояния клеток и меняется при различных воздей ствиях на них. Порфирины флуоресцируют в красной области спектра (630...670 нм).
Спектры собственной ультрафиолетовой флуоресценции раз личных клеток имеют качественное сходство. Различие в основ ном просматривается в интенсивности свечения. Наиболее интен сивно светятся клетки мышц, на 25...30 % слабее - нейроны и примерно вдвое слабее - гепатоциты. Измерение относительных величин свечения различных клеток в области 300...350 нм позво ляет получать диагностическую информацию о состоянии соот ветствующих тканей.
Поскольку флуоресценция в некоторых случаях очень слаба, для получения информации используют сторонние флуорофоры в качестве меток, или зондов. Флуоресцентные зонды, например, позволяют определить поверхностный заряд или трансмембран ный потенциал клеточных мембран, изменение конформации бел ков и т. д. С их помощью можно проводить диагностику многих заболеваний, например аллергии, токсикоза, атеросклероза, рако вых опухолей и т. д.
3.7. ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БИОТКАНЕЙ
Биоткани являются рассеивающими средами. Максимум про пускания биотканей находится в области 1,1 мкм. Наиболее «про зрачен» живой организм на длинах волн 650... 1200 нм, поскольку здесь пересекаются области наименьшего поглощения излучения водой и гемоглобином крови. Иногда еще более сужают область прозрачности мягких тканей, выделяя «окно» 800... 1100 нм. При X, = 450...620 нм глубина проникновения излучения в биоткань составляет 0,25...2,5 мм, обратное рассеяние составляет сущест венную часть отраженного света и соответствует приблизительно 40 %. Глубина проникновения зависит также от поглощения света определенных длин волн теми или иными структурами.
Кровь практически прозрачна для ИК-излучения фотографиче ского диапазона, так как окисленный и восстановленный гемогло бин в ближней ИК-области (до I мкм) поглощает и рассеивает из лучение слабо.
Рассмотрим ИК-излучение поверхности тела человека:
Спектральный диапазон, мкм........................... |
< 5 |
5-9 9-16 |
>16 |
Доля в общей излучаемой энергии, % ............ |
1 |
20 39 |
41 |
108
Максимум излучения телом человека приходится на длину волны 9,5 мкм.
Основной тканью, участвующей во взаимодействии с ЭМИ оп тического диапазона, является кожа.
Кожа состоит из эпидермиса и дермы. В состав эпидермиса входят роговой слой (570 мкм), блестящий слой (40 мкм), зерни стый слой (20 мкм), слой щиповидных клеток (90 мкм), базальный слой (20 мкм). Дерма составляет около 1000 мкм. В роговом слое основными поглощающими хромофорами являются тирозильные остатки кератина и других белков. Коротковолновая граница про пускания рогового слоя равна 280...290 нм, в нем оптическая плотность слоя больше 20. Вся кожа практически не пропускает свет с X < 300 нм, а свет с X = 290...300 нм доходит, видимо, толь ко до щиповидных клеток.
На рис. 3.8 [34] изображено спектральное пропускание излу чения кожей человека. Видно, что крайнее красное и ближнее ИК-излучения пропускаются эпидермисом и всей толщей кожи значительно лучше, чем видимое излучение. Излучение с X > > 1,5...2,0 мкм полностью поглощается содержащейся в тканях во дой, значит, кожа для этого излучения непрозрачна.
Рис. 3.8. Спектральное пропускание излучения кожей человека:
1 - эпидермисом; 2 - всей толщей кожи
На рис. 3.9 [31] представлены спектры отражения кожи чело века. В клетках кожи предусмотрена меланиновая система фото защиты, с помощью которой внутри клеток при освещении проис ходит перераспределение сильно поглощающих меланопротеиновых гранул и увеличение количества меланина. В результате
109
кожа оказывается превосходным светофильтром, не пропускаю щим в подкожные клетки свет, который может поглощаться их ядрами и ДНК, т. е. является защитой организма от избытка УФ-лучей.
///<ь%
1 - участок кожи до развития УФ-эритемы; 2 - участок кожи после развития УФ-эритемы
Физиологическое действие лучистой энергии оптической части спектра зависит от длины волны и энергии поглощенных квантов. Поглощенная энергия вызывает переход атомов и молекул в возбу жденное состояние, в котором их способность вступать в химиче скую реакцию возрастает во много раз. В коже происходит образо вание веществ с новыми физико-химическими свойствами, изменения белковых молекул клеток, усиление ферментативной деятельности. Энергия ИК-излучения и видимого света при погло щении тканями переходит в тепловую, усиливая кровообращение и тканевый обмен, повышая фагоцитозную активность лейкоцитов.
Рассмотрим оптические свойства биотканей на длинах волн ла зерного излучения УФ- и ИК-диапазонов. Стенка кровеносных сосудов обладает значительным поглощением на длинах волн ла зеров 193, 248, 308 нм, 2,94 и 10,6 мкм. Из-за интенсивного по глощения на этих длинах волн глубина проникновения составляет 1...20 мкм. Основным поглощающим компонентом на длине вол ны 890 нм является кровь. Излучение низкоинтенсивных лазеров с длиной волны 660 нм проникает только до эпидермиса, с длиной волны 820 нм - до нижней части дермы, а излучение с длиной волны 950 нм достигает подкожной клетчатки. Излучение низко интенсивных лазеров с длиной волны 630 нм проникает на глуби ну 1,5 мм, излучение ближней ИК-области 0,8...! мкм проникает в
ПО