Радиобиология / Моссэ И. Б., Морозик П. М. Генетические эффекты ионизирующей радиации

2.2.4.1. Прямая репарация ДНК

Способность клеток восстанавливать первичные повреждения, индуциро-

ванные в ДНК радиацией, впервые была показана в 1949 г. А. Кельнером [169]

иР. Дульбекко [170]. Они установили, что повторное облучение клеток длин- новолновым ультрафиолетовым светом (300 нм и выше) после предваритель- ного облучения светом длиной волны 260 нм способствует частичному сни-

жению повреждающего эффекта, индуцированного первым облучением. Этот тип восстановления повреждений в ДНК получил название фотореактивации.

Явление фотореактивации состоит в устранении видимым светом диме- ров тимина, особенно часто возникающих в ДНК под влиянием УФ-лучей. За-

мена осуществляется особым фотореактивирующим ферментом, молекулы которого не обладают сродством к участкам неповрежденной ДНК, но опозна-

ют димеры тимина и связываются с ними сразу после их образования. Этот комплекс остается стабильным, пока не подвергнется действию видимого све-

та, активирующего молекулу фермента (дезоксирибопиримидин-фотолиазы), которая отделяется от димера тимина и одновременно расщепляет димер на два отдельных тимина, восстанавливая исходную структуру ДНК.

Характерной чертой мутагенеза при действии ультрафиолетового света на клетку является необходимость в синтезе белков в клетке. Э. Виткин показала [171], что максимум мутаций достигается в тот момент, когда синтез белка снижается в результате воздействия ультрафиолетового излучения.

Таким образом, анализ закономерностей ультрафиолетового мутагенеза привел к открытию важнейшего свойства генетического аппарата, заключающегося в самоизлечивании (репарации) радиационных и химических повреж-

дений. С тех пор этот раздел генетики привлекает к себе самое пристальное внимание. Его развитие оказало существенное влияние на основы теории му-

тагенеза и на разработку методов защиты ДНК от мутагенных повреждений.

Вначале 1960-х годов было обнаружено, что восстановление повреждений в ДНК может происходить и без активации клеток видимым светом. Это явле-

ние восстановления повреждений в ДНК получило на тот момент название темновой репарации. В 1964 г. Р. Сетлоу и В. Карриер [172] и независимо от них Р. Бойс и П. Говард-Фландерс [173] выяснили молекулярные основы этого процесса.

Исследования показали, что темновая репарация имеет две основные фор- мы – конститутивная и индуцибельная репарации. Последняя возникает толь-

ко при наличии внешних воздействий.

Конститутивная репарация может проходить в период до синтеза ДНК (дорепликативная, или эксцизионная, репарация) или после синтеза ДНК (по-

стрепликативная репарация).

Индуцибельная репарация представлена так называемой SOS-репарацией

ирепарацией в виде адаптивного ответа клетки на предварительное воздей-

ствие мутагеном.

90

репарационного процесса необходимо модифицировать образовавшиеся 3’- и 5’-блокирующие концевые участки до обычных 3’-OH и 5’-фосфатного концов, необходимые для работы ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы. Удаление этих аномальных концов осуществляется различными ферментами в зависи-

мости от того, в каком участке (3’- или 5’-) произошло отщепление АР-сайта. Например, фермент APE1 дополнительно обладает 3’-фосфодиэстеразной ак-

тивностью, что позволяет ему восстанавливать 3’-OH из 3’-фосфо-α, β-нена- сыщенного альдегида. Продукт 3’-фосфат катализируется в 3’-OH благодаря 3’-фосфатазной активности фермента PN P (полинуклеотидкиназа-3’-фос- фатаза). Модификация 5’-дезоксирибозофосфатного конца осуществляется благодаря дезоксирибофосфатной лиазной активности фермента ДНК-полиме-

разы β [179].

Следующим шагом в процессе эксцизионной репарации оснований явля- ется восстановление разрывов ДНК путем синтеза и ее лигирования (сшива-

ние, восстановление фосфодиэфирной связи). Существует две разновидности процесса синтеза / лигирования ДНК: репарация короткими фрагментами и репарация длинными фрагментами, в зависимости от того, один или не-

сколько нуклеотидов инкорпорируется в разрыв цепи ДНК, соответственно. При репарации короткими фрагментами заполнение однонуклеотидных раз-

рывов и удаление 5’-дезоксирибозофосфатного конца осуществляется ДНКполимеразой β с последующим лигированием концов ДНК лигазой . Репара- ция короткими фрагментами составляет около 80–90 % от числа всех эксци-

зионных репараций оснований.

Процесс эксцизионной репарации оснований длинными фрагментами только инициируется с помощью лиазной активности ДНК-полимеразы β, однако в дальнейшем (начиная со второго нуклеотида) для его осуществления требу- ется весь ряд белков, участвующих в репликации ДНК, включая ДНК поли-

меразы δ или ε, факторы пролиферации и репликации, эндонуклеазы и ДНКлигазы .

Таким образом, эксцизионная репарация оснований (BER) представляет собой многоступенчатый процесс, включающий последовательную актив- ность нескольких белков и имеющий различные точки инициации в зависи-

мости от типа повреждения. В результате BER вся структура ДНК полностью восстанавливается: неправильное основание удалено, сахарофосфатный остов, к которому это основание было прикреплено, вырезан из нити ДНК, брешь за-

полнена правильными нуклеотидами, и все однонитевые разрывы залечены.

2.2.4.3. Эксцизионная репарация неспаренных оснований

(mismatch repair – MMR)

Система эксцизионной репарации неспаренных оснований имеет важное значение для пост-репликативной репарации ошибок спаривания нуклеоти- дов, которые не были вовремя распознаны и удалены репликационными по-

92

лимеразами. Кроме этого, система MMR также способна проводить коррекцию коротких инсерционных и делецион- ных петель ( DL), образующихся в ре-

зультате проскальзывания полимеразы в процессе репликации повторяющихся последовательностей ДНК [180]. Значи- мость этого процесса также подтверж-

дается тем фактом, что в MMR дефицитных клетках формируется мутант- ный фенотип, характеризующийся неиз- менно микросателлитной нестабильно-

стью и повышенной частотой мутаций. Процесс MMR можно разделить на три основных этапа: 1) узнавание оши-

бочно спаренного основания; 2) вырезание Рис. 2.5. Механизм эксцизионной репара-

участка нити ДНК, содержащего ошибоч- ции неспаренных оснований [178] ное основание, с образованием разрыва;

3) репарационный синтез (восстановление исходной последовательности ДНК,

рис. 2.5).

2.2.4.4. Эксцизионная репарация нуклеотидов

(nucleotide excision repair – NER)

Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER) позволяет определять и уда-

лять из ДНК практически все возможные типы повреждений. В процессе NER происходит миграция различных репарационных белков в месте поврежде-

ния ДНК [181]. Механизм NER во многом совпадает с BER, однако является более комплексным и включает распознавание поврежденного участка ДНК, локальное раскручивание спирали ДНК в месте повреждения, вырезание ко-

роткого одноцепочечного поврежденного участка ДНК и последовательный репаративный синтез и лигирование цепи (рис. 2.6). Огромное значение экс- цизионной репарации нуклеотидов для организма подтверждается тем фак- том, что дефекты в его работе приводят к развитию множества наследствен-

ных заболеваний [182].

NER может осуществляться двумя путями – общей репарацией генома (Global Genome NER – GG-NER) и репарацией, спаренной с транскрипцией

(transcription-coupled NER – TC-NER). Отличия состоят в том, что с помощью процесса GG-NER эллиминируются повреждения из всего генома, а при TC-NER – повреждения в кодирующей последовательности ДНК в процессе транскрипции. Механизмы обоих процессов идентичны, за исключением пер-

вого этапа распознавания повреждения.

93

Рис. 2.6. Схематическое изображение процесса эксцизионной репарации нуклеотидов [183]

2.2.4.5. Репарация двунитевых разрывов

Двунитевые разрывы являются одними из наиболее опасных типов по-

вреждений ДНК и практически всегда приводят к гибели клетки. Они могут возникать спонтанно или после воздействия на клетку ионизирующей радиа- ции, химических мутагенов. Ошибочная репарация таких повреждений мо- жет приводить к образованию делеций или хромосомных аберраций, способ-

ствующих опухолевой трансформации клеток или формированию геномной нестабильности [184].

Существует два основных механизма, с помощью которых происходит ре-

парация двунитевых разрывов ДНК: путем гомологичной рекомбинации (HR, рис. 2.7) и путем негомологичного воссоединения концов (NHEJ, рис. 2.8). От-

личие этих двух механизмов состоит в необходимости участия гомологичного участка ДНК и точности репарации двунитевых разрывов. HR-репарация

94

в основном протекает без ошибок, так как в ее процессе используется в каче- стве матрицы генетическая информа-

ция, расположенная в неповрежденных сестринских хроматидах [185]. NHEJ-ре- парация протекает путем прямой сшив-

ки поврежденных концов, в результате чего обычно образуются ошибки [186]. По типу NREJ репарируется большинство двунитевых разрывов в клетках млекопитающих на всех стадиях кле-

точного цикла, в то время как HR-ре- парация возможна только на поздних S и G2 фазах. Главной задачей систем репарации двунитевых разрывов явля-

ется необходимость восстановления структуры поврежденной хромосомы, т. е. сшивания двух концов ДНК. Для этого необходимо их быстрое обнару-

жение в ядре и изоляция от возможного взаимодействия с другими разрывами. Появление двунитевых разрывов ДНК

часто сопровождается сопутствующими повреждениями азотистых основа- ний и сахарофосфатного каркаса ДНК. Такие повреждения должны быть уда-

лены с концов ДНК с помощью нуклеаз до их сшивания ДНК-лигазами. За счет этого при NHEJ-репарации в местах воссоединения практически всегда образуются микроделеции. Учитывая, что геномы высших эукариот более чем

Рис. 2.8. Схематическое изображение процесса репарации двунитевых разрывов путем него-

мологичного воссоединения концов рекомбинации [183]

95

на 90 % состоят из некодирующих последовательностей, это редко приводит к серьезным мутациям.

Таким образом, в настоящее время открыто и описано множество меха- низмов репарации. Одни более просты и протекают сразу после возникнове- ния повреждения, другие растянуты во времени и требуют присутствия мно-

жества различных компонентов. Открытие и детальное изучение процессов репарации ДНК стало одним из интереснейших и важных достижений моле- кулярной генетики второй половины XX в. При этом исследование процессов

репарации идет полным ходом, новые и новые принципы появляются каждый год. И сегодня уже стало очевидным, что от того, как клетки справляются с повреждениями, зависит возникновение не только мутаций, но и наслед- ственных заболеваний, раковых клеток, а также процесс старения всего орга-

низма.

2.3.Организменный уровень

2.3.1.Радиочувствительность организма

Генетическая детерминированность радиочувствительности. С точки зрения генетики радиочувствительность является одним из количественных признаков, таких как рост, вес, плодовитость и т. д. Наследственные различия особей по радиочувствительности, как и по другим количественным призна- кам, обусловлены взаимодействием многих пар полимерных генов, определя- ющих целый ряд физиологических и биохимических особенностей организ- ма. Например, генотипы различаются по содержанию в клетках ауторадио- протекторов и аутоантимутагенов, таких как эндогенные антиоксиданты и се-

росодержащие вещества, находящиеся в клетках или синтезирующиеся в них под влиянием облучения; по уровню репаративных процессов и т. д. Поэтому особи отвечают на воздействие облучения в одной и той же дозе по-разному.

Повреждения даже на уровне ДНК не всегда полностью адекватны погло- щенной дозе радиации, поскольку возможна миграция энергии с ДНК на про-

тектор, если он находится в клетке на расстоянии не более 100 ангстрем от ДНК. На уровне хромосомы радиационный эффект зависит от ее конденса- ции, белково-нуклеиновых взаимодействий, соотношения эу- и гетерохрома- тина и т. д. Что же касается клетки, то в ней работают такие мощные модифи-

каторы облучения, как репарационные ферменты и радиоадаптивный ответ, происходит амплификация генов, ответственных за радиоустойчивость, включение мобильных генетических элементов и пр. На уровне ткани радиа- ционные эффекты модифицируются элиминацией поврежденных клеток (апоп- тоз), явлениями адаптации и генетической нестабильности. Огромное количе-

ство факторов влияет на результаты радиационных воздействий на уровне организма, например, состояние биохимических и физиологических систем, наличие наследственных болезней, отбор на уровне гамет и на уровне зигот. Все перечисленные явления детерминированы генетически.

96

Генетическими факторами, влияющими на радиочувствительность явля- ются следующие: эффективность работы репарационных систем; наличие эн- догенных радиопротекторов и антимутагенов; скорость синтеза АТФ и дру-

гих необходимых белков и ферментов; амплификация генов, ответственных за радиорезистентность; включение мобильных элементов; наследственные заболевания и т. п.

Влияние на радиочувствительность средовых факторов. Радиочувстви-

тельность, как и все другие количественные признаки, в большой степени за-

висит и от факторов внешней среды.

К негенетическим факторам, влияющим на радиочувствительность, отно-

сятся: диета;

двигательная активность; нервно-психическое состояние; гормональный баланс; прием лекарств и пищевых добавок;

ненаследственные заболевания.

Внастоящее время анализ экологических факторов радиочувствительно-

сти проводится во многих лабораториях мира.

О роли диеты в радиочувствительности свидетельствуют многие факты. Так, пустынные тушканчики обладают очень высокой для млекопитающих устойчивостью к радиации. Для того чтобы выяснить причины такой рези-

стентности, их поместили в условия вивария. Перевод животных на пищевой рацион обычных лабораторных крыс и мышей привел к неожиданным резуль- татам – к снижению их радиоустойчивости. Оказалось, что низкая радиочув-

ствительность тушканчиков была обусловлена их диетой – травами, которые употребляют пустынные грызуны. Кормление белых крыс и мышей этими травами повышало их устойчивость к действию радиации.

Аналогичные результаты получены при наблюдении за летучими мыша-

ми. В естественных условиях их устойчивость к радиации примерно такая же, как у большинства млекопитающих, однако в неволе они отказываются от пищи и при этом становятся в 20–50 раз более устойчивыми к радиационному воздействию.

Показано, что ряд химических веществ способны усиливать генетические эффекты ионизирующих излучений. Например, нами показано, что нитрит

инитрат натрия, которые широко используются в качестве удобрений и оста- точные количества которых находятся во многих сельскохозяйственных про- дуктах, усиливают мутагенное действие радиации, хотя сами не являются му-

тагенами – наблюдается эффект сенсибилизации [187].

Вто же время многие пищевые продукты содержат антимутагены. Поэто- му на резистентность организма влияет рацион питания: пища, богатая вита-

минами, микроэлементами, адаптогенами и т. д. способствует повышению радиорезистентности. Многие пищевые продукты содержат антимутагены.

97

Например, чай, кофе, какао, шоколад, грибы, черный виноград, черная икра

ит. д. содержат пигмент меланин, который эффективно снижает выход гене-

тических повреждений, вызываемых облучением в половых и соматических клетках и в том числе в лимфоцитах человека [188]. Антимутагенными свой- ствами обладают и токоферол (витамин Е), и другие природные антиоксидан- ты [189]. Все они могут снижать частоту мутаций, индуцированных ионизи-

рующей радиацией.

Физическая нагрузка, изменение температуры тела и другие воздействия, изменяющие метаболизм, оказывают заметное влияние на радиоустойчивость. Еще в 1950-е годы работами Дж. Сторера и Л. Гомпельмана [190], Р. Анджус

иА. Смит [191] было показано, что снижение температуры тела крыс, мышей

ихомяков до +5° – 0 °С оказывает выраженный радиозащитный эффект. Веро-

ятно, это связано с угнетением метаболизма. О том же говорят и наблюдения за сурками, сусликами и рядом других животных в состоянии зимней спячки. Летальные дозы для них в это время достигают порядка десятков и сотен грей. Если животных тотчас после облучения вывести из состояния спячки, то лучевое поражение развивается быстро и наблюдается при тех же дозах, что и у бодрствующих животных, т. е. при дозах 1–10 Гр. Интересно, что в некоторых случаях понижение температуры тела приводит к увеличению радиочувствительности у гомойотермных животных. Вероятно, это связано с компенсаторным усилением метаболизма и, как следствие, к возрастанию лучевого поражения.

На уровень радиочувствительности влияют также двигательная актив- ность, нервно-психическое состояние, гормональный баланс, наличие заболе- ваний негенетической природы (особенно вирусных) и т. п. Безусловно, и при-

ем лекарственных препаратов, и многие другие факторы, воздействующие на организм, могут существенно изменить его радиочувствительность в данный конкретный момент.

Таким образом, радиочувствительность особей зависит как от генетиче-

ских особенностей организма, так и от многочисленных факторов окружающей среды. Поэтому она может меняться, и отдельные особи в каждый конкрет- ный момент могут переходить из одной группы в другую и обратно (напри-

мер, из группы «а» в группу «б», из группы «г» в «в» и т. д. (п. 2.4.2, рис. 2.13). Но в среднем, в популяции будет сохраняться нормальное распределение осо-

бей по признаку радиочувствительности.

Влияние генотипа и среды на радиочувствительность можно наглядно продемонстрировать с помощью пигмента меланина. Известно, что одной из основных функций этого пигмента является защита клеток от УФ-радиации. В ряде работ было показано, что высокое содержание эндогенного меланина (в частности в меланомах), а также добавление экзогенного меланина способ-

ствует возрастанию общей радиорезистентности клеток и организмов [51]. Было исследовано влияние меланина на генетические последствия ионизиру-

ющей радиации и показано, что инъекции или скармливание этого пигмента

98

снижают в 2–4 раза частоты мутаций, вызываемых облучением в половых клетках животных [187].

Эти данные показывают, что радиационный риск как популяционный, так и индивидуальный в гораздо большей степени, чем это предполагалось ранее, зависит от содержания меланина в организме (очевидно, белая раса менее устойчива, чем желтая и черная). Кроме того, можно повысить радиорези-

стентность организма с помощью меланина, введенного извне.

Таким образом, результаты, полученные многими исследователями, сви-

детельствуют о генетической детерминированности радиочувствительности. Можно привести в качестве примера вывод К. Мазерсил: «Ясно, что генетиче- ская предрасположенность является решающей и может быть даже более важ-

ной, чем доза» [192].

2.3.2. Зависимость индукции радиационных мутаций от дозы излучений

Открытие того факта, что между количеством мутаций, возникающих под действием радиации, и дозой радиации имеется прямая зависимость, сыграло очень важную роль в истории радиобиологии, положив начало широкому применению количественных методов исследования. Во многих эксперимен- тах установлена прямая линейная зависимость генетического эффекта излуче-

ний от дозы. Известна прямолинейная зависимость количества лизогенных клеток кишечной палочки, в которых профаг переходит в фаг, от дозы рентге-

новских лучей. Такого рода связь установлена для многих мутаций у разных организмов. Поэтому принято считать, что частота возникновения генетиче- ских эффектов прямо пропорциональна дозе облучения, и дозовая кривая на-

чинается от нулевой точки, т. е. какой бы малой ни была доза радиации, всегда есть риск возникновения мутации. В настоящее время вопрос о действии малых доз радиации в диапазоне от доли рентгена до 10–20 Р тщательно изучается.

Что касается разрывов хромосом, то они также появляются в прямолиней-

ной зависимости от дозы. При этом для того чтобы фрагменты, возникающие при независимых разрывах, могли бы вступить в новые соединения, ведущие к появлению хромосомной перестройки, они должны появиться сравнительно близко друг к другу. Расчеты показывают, что это расстояние не должно пре- вышать 1 мкм. При этом количество хромосомных перестроек, каждая из ко-

торых требует для своего возникновения наличия в ядре двух независимых разрывов, в соответствии с теорией вероятности возрастает пропорционально квадрату дозы. Поэтому такая зависимость называется квадратичной, и эф-

фект пропорционален не дозе, как в случае прямолинейной зависимости, а квадрату дозы (рис. 2.9).

Иногда изучаемые эффекты имеют смешанное происхождение – напри- мер, рецессивные мутации могут быть и точковыми мутациями, и микроабер-

рациями. В этом случае используют линейно-квадратичную модель.

99