лот и окисление субстратов. В основе дыхательного контроля тесная функциональная связь между движением электронов по дыхательной цепи и синтезом АТФ. Процесс окислительного фосфорилирования регулируется соотношением АТФ/АДФ. Образовавшаяся АТФ из матрикса в цитоплазму переносится ферментами транслоказами, при этом в обратном направлении в матрикс переносится одна молекула АДФ и одна молекула фосфорной кислоты. Понятно, что нарушение транспорта АДФ и фосфата тормозит синтез АТФ. Скорость окислительного фосфорилирования зависит в первую очередь от содержания АТФ, чем быстрее она расходуется, тем больше накапливается АДФ, тем больше потребность в энергии и, следовательно, активнее идет процесс окислительного фосфорилирования. Регуляцию скорости окислительного фосфорилирования концентрацией в клетке АДФ называют ды-
хательным контролем.
Разобщение тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования.
Эффективность окислительного фосфорилирования в митохондриях определяется как отношение величины образовавшегося АТФ к поглощенно-
му кислороду: АТФ/О или Р/О (коэффициент фосфорилирования). Экспериментально определяемые значения Р/О, как правило, оказываются меньше 3, а учитывая необходимость определенных затрат протонного градиента на перенос АТФ в цитоплазму с обменом ее на АДФ и Н2РО4─, требующим одновременного переноса Н+ в митохондрию, полагают, что на 1 моль О, или на два моля электронов, использованных для восстановления кислорода до воды в митохондриях, в клетке не может образоваться более 2,5 моль АТФ. Это свидетельствует о том, что процесс дыхания не полностью сопряжен с фосфорилированием. При полном сопряжении этих процессов 220 кдж энергии, освобождающейся при окислении 1 моль НАДН кислородом до воды и НАД+, хватило бы на образование более 5 моль АТФ. Степень сопряжения зависит главным образом от самого механизма сопряжения, при котором энергия электронов расходуется на выкачивание протонов из митохондрий и создание протонного градиента (электрохимического мембранного потенциала), который в свою очередь используется для синтеза АТФ. В этом процессе важнейшую роль играет целостность митохондриальной мембраны, удерживающей электрохимический потенциал, создаваемый транспортом электронов.
Некоторые химические вещества, ионофоры, могут, растворяясь в липидном бислое митохондриальной мембраны, переносить ионы через мембрану; протонофоры могут усиливать протонную проводимость митохондриальной мембраны, перенося протоны из межмембранного пространства через мембрану в матрикс, минуя протонные каналы АТФ-синтазы, а другие ионофоры переносят другие ионы. В результате таких процессов уменьшается электрохимический мембранный потенциал и уменьшается, и даже прекращается синтез АТФ. Это явление называют разобщением дыхания и фосфорилирования. В результате разобщения количество АТФ снижается, а
41
концентрация АДФ увеличивается. При этом возрастает скорость окисления ФАДН2 и НАДН, а также количество потребленного кислорода, но энергия в основном выделяется в виде теплоты. Происходит рассеивание энергии, которая не фиксируется в виде макроэргической связи молекулы АТФ, а принимает вид тепловой энергии. Соединения, обеспечивающие протонную проводимость и понижающие электрохимический потенциал, называются раз-
общителями.
Одно из таких веществ 2,4-динитрофенол, легко переходящий из ионизированной формы в неионизированную, присоединяя протон в межмембранном пространстве и перенося его в матрикс. Примерами разобщителей могут также быть лекарства (дикумарол) или метаболиты, которые образуются в организме (билирубин), а также тироксин – гормон щитовидной железы, но эти вещества проявляют свое разобщающее действие только при высокой концентрации.
Разобщение окисления и фосфорилирования также может возникать при некоторых воздействиях на организм или ткани (например, при переохлаждении),
Разобщение процессов дыхания и окислительного фосфорилирова-
ния происходит, если протоны начинают проникать через внутреннюю мембрану митохондрий. В этом случае выравнивается градиент рН и исчезает движущая сила фосфорилирования. Формулы некоторых веществразобщителей приведены ниже.
1-(2-дицианометилен)гидразино-4-трифторметоксибензол, или карбонилцианид n-трифторметоксифенилгидразона, и 2,4-динитрофенол (соответ-
42
ственно формулы I и II; показаны в протонированной и депротонированной формах). Обладая липофильностью, они легко переносят протоны через мембрану митохондрий.
В отличие от ингибиторов дыхания (цианидов) разобщающие агенты не влияют на движение электронов по дыхательной цепи; обычно они оказывают противоположное действие, значительно повышая скорость процессов клеточного дыхания. Однако такое ускоренное дыхание не приводит к образованию АТФ. Иными словами, процессы фосфорилирования и окисления уже не сопряжены друг с другом. Это приводит к нерегулируемому, бесплодному дыханию, при котором освобождающаяся энергия целиком рассеивается в виде тепла. Ядовитые нитрофенолы и другие разобщающие агенты, попав в организм, стимулируют обмен веществ и теплообразование, что приводит к повышению температуры тела.
ПУТИ ТРАНСПОРТА ЭЛЕКТРОНОВ ИЗ ЦИТОПЛАЗМЫ В МИТОХОНДРИИ.
Челночные механизмы – специальные ферментные системы, необходимые для переноса восстановительных эквивалентов (электронов) из цитоплазмы в митохондрии для их поступления в цепь транспорта электронов и использования в восстановлении кислорода, создания протонного градиента, и получения АТФ за счет окислительного фосфорилирования. Необходимость челночных механизмов связана с особенностями строения митохондриальной мембраны, которая представлена внутренней и наружной мембраной митохондрий. Наружная мембрана митохондрий легко проницаема для всех молекул и ионов небольшого размера. Внутренняя мембрана митохондрий для большинства веществ и ионов даже небольшого размера, в том числе для протонов, НАД+ и НАДН непроницаема. Поэтому для транспорта электронов и протонов используются те вещества, которые легко проходят через внутреннюю мембрану митохондрий и используются в челночных механизмах. К наиболее важным из них относятся глицерофосфатный и малатаспартатный челночные механизмы.
Глицерофосфатный челночный механизм основан на восстановлении образующегося при гликолизе фосфодигидроксиацетона (дигидрокси-
ацетонфосфата) цитоплазматической глицерофосфатдегидрогеназой (1),
использующей восстановленный НАДН, до α-глицерофосфата, который легко проникает через обе мембраны митохондрии в матрикс и на внутренней мембране окисляется с помощью митохондриальной ФАД-зависимой гли-
церофосфатдегидрогеназы (2) до дигидроксиацетонфосфата, легко переходящего через мембраны митохондрии в цитозоль клетки. Образующийся ФАДН2 далее через флавинзависимый транспортирующий электроны фермент ЕТФ отдает свои электроны и протоны на коэнзим Q (убихинон) в митохондриальную цепь транспорта электронов, где в результате использова-
43
ния 2 моль электронов в процессе окислительного фосфорилирования генерируется до 1,5 моль АТФ.
Этот механизм широко используется различными тканями, особенно печеночной и мышечной тканью, в процессе интенсивной мышечной работы.
Малат-аспартатный челночный механизм является более сложным,
но и более энергосберегающим. Он использует избыток восстановленного цитоплазматического НАДН в реакции восстановления оксалоацетата (щавелевоуксусной кислоты) до малата (яблочной кислоты) с помощью НАД-
зависимого цитоплазматического фермента малатдегидрогеназы (4). Яб-
лочная кислота легко проникает в матрикс через обе мембраны митохондрии, где окисляется митохондриальной также НАД-зависимой, малатдегидрогеназой (5) до оксалоацетата. Далее электроны от полученного НАДН поступают в цепь транспорта электронов, где в процессе окислительного фофорилирования на 2 моль электронов генерируется до 2,5 моль АТФ. Образующийся оксалоацетат не может покинуть митохондрию, он подвергается реакции переаминирования с участием глутаминовой кислоты (глутамата) под действием митохондриальной аспартатаминотрансферазы (3). В резуль-
тате образуется аспарагиновая кислота (аспартат), которая с помощью специфической транспортной системы переходит из митохондрии в цитоплазму,
где под действием цитоплазматической аспартатаминотрансферазы (2)
отдает свою аминогруппу α-кетоглутаровой кислоте (α-кетоглутарат), превращаясь в оксалоацетат. Следует заметить, что α-кетоглутарат и глутамат легко проникают через внутреннюю мембрану митохондрии используя специальную ферментную транспортную систему — глутамат-α-кетоглутарат- транслоказу (1). Внутренняя мембрана митохондрий содержит целый ряд переносчиков для ионов и заряженных метаболитов: например, переносчик дикарбоновых кислот опосредует облегченную обменную диффузию малата, сукцината, фумарата и Н2РО4–, а переносчики трикарбоновых кислот обеспечивают обмен ОН– и Н2РО4–. Из наиболее важных транслоказ – ферментов, осуществляющих специфический транспорт веществ через внутреннюю мембрану митохондрий необходимо упомянуть АТФ-АДФ-транслоказу, осуществляющую транспорт в цитоплазму синтезирующейся в митохондриях
44
АТФ в обмен на поступающие в митохондрию АДФ и неорганический фосфат ион, вносящий в митохондрию дополнительный протон.
ТЕРМОГЕНЕЗ
Терморегуляторная функция тканевого дыхания.
Около 55 % энергии полного расщепления глюкозы аккумулируется в макроэргических связях аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) и используется для обеспечения функций клетки или пластичных процессов в ней. Остальная часть энергии является непосредственным источником теплообразования. Несопряженное дыхание выполняет важную терморегуляторную функцию. Оно обеспечивает поддержание температуры тела на более высоком уровне, чем температура окружающей среды. Степень сопряженности дыхания и фосфорилирования в клетках является регулируемым процессом, связанным с состоянием митохондрий. В патологических условиях митохондрии могут длительное время находиться в набухшем состоянии. Это стимулирует гликолиз. При действии холода организм нуждается в срочной мобилизации тепла, которая происходит путем разобщения окислительного фосфорилирования и свободного окисления. При таком разобщении энергетический обмен клетки направляется в сторону повышенного образования тепла за счет временного снижения специфической функции клетки.
В норме интенсивность митохондриального транспорта электронов регулируется содержанием АДФ. Выполнение клеткой функций с затратой АТФ приводит к накоплению АДФ, который в свою очередь активирует тканевое дыхание, осуществляя таким образом дыхательный контроль, что позволяет клеткам правильно реагировать на интенсивность клеточного метаболизма и поддерживать запасы АТФ на необходимом уровне. За счет наличия дыхательного контроля возможна терморегуляторная функция тканевого дыхания: процессы разобщения тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования приводят к повышению температуры тела. Благодаря этому эволюционно стало возможным поддержание оптимальной температуры тела, для протекания всех жизненно важных биологических процессов и незави-
45
симость от условий окружающей среды. Однако без дыхательного контроля разобщение между процессами тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования могут привести к необратимому повышению температуры тела и гибели организма.
Цепь переноса электронов как часть системы дыхания, начинающейся с вдыхания воздуха и связывания кислорода гемоглобином.
Благодаря тканевому дыханию при участии специфических ферментов происходит окислительный распад крупных органических молекул — субстратов окисления — до более простых и в конечном счете, до СО2 и Н2О с высвобождением энергии. Ферментами дыхания являются переносчики протонов и электронов от окисляемого субстрата на кислород, эти переносчики и обеспечивают уже описанную выше дыхательную цепь.
Необходимость в кислороде обеспечивается системой дыхания, в которой важнейшую роль в доставке кислорода в ткани обеспечивают эритроциты, отдающие в легких углекислоту и связывающие кислород — четыре молекулы кислорода на 1 молекулу гемоглобина. Потеря углекислоты повышает рН, снижая концентрацию Н+ в эритроцитах, и способствует облегчению связывания гемоглобином О2, при этом железо гема, находясь в степени окисления +2, не изменяет своей степени окисления. При попадании с током крови в ткани, где рН среды несколько ниже, а, следовательно, выше концентрация протонов, чем в легких и крови, эритроциты отдают тканям кислород гемоглобина, связывая СО2 в гидрокарбонат ионы. Промежуточным депо кислорода в некоторых тканях (в основном в мышечной ткани) может быть миоглобин. В клетки и в митохондрии кислород поступает по градиенту концентрации. Каких-либо специфических переносчиков кислорода пока не выявлено. В митохондриях кислород восстанавливается, принимая на себя электроны из цепи дыхательных ферментов, являясь терминальным акцептором электронов.
Нарушения энергетического обмена: гипоэнергетические состояния как результат гипоксии, гипоавитаминозов и др. причин.
Нарушения энергетического обмена лежат в основе большинства функциональных и органических нарушений органов и тканей. Все энергетические нарушения реализуются на молекулярном уровне. Нарушения на клеточном уровне зависят от повреждения цитоплазматических включений - мембран митохондрий, лизосом, эндоплазматического ретикулума. Чаще всего эти повреждения вызываются нарушением биосинтеза нуклеиновых кислот, активацией окисления, действием токсинов, а также нарушением нервной и гуморальной регуляции. На органном и тканевом уровне последствием энергетических нарушений является изменение специфической функции соответствующих органов и тканей. На уровне целостного организма нарушения энергетического обмена обычно связаны с нарушением регуляторной функции нервной и эндокринной систем.
46
Нормальное течение обменных процессов на молекулярном уровне обусловлено динамическим взаимодействием процессов катаболизма и анаболизма.
Анаболизм - это ферментативный синтез клеточных компонентов, совершающийся с потреблением энергии.
Катаболизм - это ферментативное расщепление пищевых и собственных молекул с освобождением заключенной в них энергии. Катаболизм может совершаться внеклеточно с помощью пищеварительных ферментов и внутриклеточно при участии лизосомальных гидролаз. Внутриклеточному распаду подвергаются собственные макромолекулы, имеющие неинформационные нарушения, приобретенные в результате случайных ошибок синтеза, либо других повреждений. Продукты их распада используются клеткой для синтеза других компонентов. Генетическая недостаточность лизосомальных ферментов приводит к возникновению болезней накопления. Примером внеклеточного распада макромолекул является протеолиз.
При нарушении катаболических процессов, прежде всего, страдает регенерация АТФ, а также поступление необходимых для анаболизма субстратов. В свою очередь, повреждение анаболических процессов приводит к нарушению воспроизведения ферментов и гормонов, необходимых для осуществления катаболизма. Наиболее выраженные нарушения катаболизма наблюдаются при повреждении механизмов сопряжения дыхания и окислительного фосфорилирования. Окислительное фосфорилирование нарушается при авитаминозах, особенно группы В, поскольку многие из них входят в состав коферментов цикла трикарбоновых кислот и переноса электронов в дыхательной цепи.
Наиболее частой причиной гипоэнергетических состояний является гипоксия, возникновение которой в свою очередь связано с нарушением:
поступления кислорода в кровь, что наблюдается при недостаточности О2 во вдыхаемом воздухе или нарушении легочной вентиляции;
транспорта кислорода в ткани при нарушении кровообращения или снижении транспортной функции гемоглобина;
функций митохондрий, вызванное действием ядов, разобщителей.
Кроме того, причиной гипоэнергетических состояний могут быть гиповитаминозы, так как в реакциях общих путей катаболизма и дыхательной цепи участвуют коферменты, содержащие витамины. Так, витамин В1 входит в состав тиаминдифосфата, В2 является составной частью ФМН и ФАД, витамин РР в виде никотинамида входит в состав НАД+ и НАДФ+, пантотеновая кислота - в состав кофермента А, биотин также выполняет коферментную функцию активации СО2.
Продукция тепла у человека происходит 3 путями:
1.Произвольная мышечная активность;
47
2.Непроизвольная тоническая активность скелетной мускулатуры (высокоинтенсивная, характеризуемая беспокойством ребенка, видимым тремором, так называемое "мышечное дрожание");
3."Немышечный" термогенез.
Если у взрослых "мышечное дрожание" является наиболее значимым механизмом регуляции тепла, то у новорожденных теплопродукция осуществляется в основном за счет химического компонента термогенеза. Наибольший процент "немышечного" тепла у детей образуется при окислении бурого жира, который у доношенного новорожденного составляет 6-8% от массы тела. Бурый жир - это уникальная ткань, закладка которой происходит после 26-30 недели внутриутробного развития. Запасы его можно обнаружить в области шеи, между лопатками, за грудиной, вокруг почек и надпочечников. Бурый жир отличается как морфологически, так и по метаболизму от более распространенного белого жира. Клетки содержат большое количество митохондрий и жировых вакуолей. Их метаболизм регулируется центром терморегуляции и стимулируется норадреналином (а не адреналином, как у взрослых) через симпатическую иннервацию в ответ на холод. В результате происходит гидролиз триацилглицеридов на свободные жирные кислоты и глицерин, являющиеся важными источниками энергии в периоде новорожденности.
Термогенная функция энергетического обмена в бурой жировой ткани.
В процессе эволюции у гомойотермных животных и человека сформировались специальные ткани (бурый жир), функцией которых является поддержание постоянной высокой температуры тела за счет регулируемого разобщения окисления и фосфорилирования в митохондриальной дыхательной цепи. Процесс разобщения контролируется гормонами.
Бурая жировая ткань [БЖТ] у человека формируется уже во время внутриутробного развития. У новорожденного количество БЖТ достигает 8% от веса тела. Она располагается между лопатками, позади грудины, вокруг шеи и между ее сосудами, в подмышечных впадинах, вдоль позвоночника, в воротах почек. В течение 1 года жизни БЖТ превращается в белую жировую ткань. У взрослого БЖТ почти не обнаруживается, однако, полностью не исчезает. Ее содержание может увеличиваться у пожилых людей при некоторых заболеваниях; БЖТ может быть источником развития доброкачественных опухолей - липом. Клетки БЖТ - адипоциты - оплетены густой сетью капилляров, имеют многочисленные жировые включения в цитоплазме, которые не сливаются друг с другом и не образуют единой капли, как в липоцитах белой жировой ткани. Помимо нейтральных жиров, в них много жирных кислот, холестерина и фосфолипидов. Характерный цвет БЖТ связан с обильной васкуляризацией, большого количества в ней митохондрий и высоким содержанием в митохондриях окрашенных окислительных ферментов — цитохромов.
48
Гистологическое строение адипоцитов белой (левый рисунок) и бурой (правый рисунок) жировой ткани: 1 - ядро; 2 - жировые включения 3 - митохондрии.
Ведущая функция БЖТ - термогенез - обеспечивается структурными и функциональными особенностями присущих ей митохондрий. В них имеется белок термогенин, обусловливающий разобщение метаболических процессов окисления и фосфорилирования. Термогенин, являющийся природным разобщающим агентом, это протонный канал мембраны митохондрий бурых жировых клеток. В буром жире, при охлаждении организма норадреналин активирует гормонзависимую липазу. Благодаря интенсивному липолизу в организме образуется большое количество свободных жирных кислот, которые распадаются в результате β-окисления. Так как жирные кислоты одновременно открывают протонный канал термогенина, их распад и дальнейшее освобождение энергии электронов не зависит от наличия АДФ, то есть протекает с максимальной скоростью и генерирует энергию в форме тепла.
В результате окисление жиров служит не накоплению энергии в форме макроэргических соединений, а образованию значительного количества тепла. Обильное кровоснабжение БЖТ реализует быстрое отведение вырабатываемого тепла. При стимуляции симпатической нервной системы активность окислительных процессов в БЖТ возрастает в сотни раз и сопровождается многократным усилением кровотока в ее сосудах. БЖТ хорошо развита у новорожденных, обладающих несовершенной функцией терморегуляции и у животных, впадающих в зимнюю спячку (гибернантов). БЖТ является депо жиров - высококалорийного резервного материала. Различные заболевания (пневмонии, анемии, интоксикации) сопровождаются истощением БЖТ, резким снижением теплопродукции, что может способствовать возникновению переохлаждения у новорожденных.
Бурая жировая ткань обладает уникальными метаболическими свойствами. Как большинство других тканей, она способна окислять субстраты в своих митохондриях посредством цикла трикарбоновых кислот, но в отличие от других тканей, этот процесс отделен от образования АТФ при стимуляции ткани симпатической нервной системой. Во всех тканях, содержащих митохондрии, электронная транспортная цепь переносит протоны на наружную сторону внутренней мембраны, создавая протонный градиент между двумя сторонами внутренней мембраны митохондрий. Это способ временного запа-
49
сания энергии, выделяющейся при окислении субстрата. Протонный градиент снижается за счет пассивного транспорта протонов обратно в матрикс через ферментный комплекс АТФ-синтазы, что приводит к образованию АТФ из АДФ и неорганического фосфата. В митохондриях бурой жировой ткани этот процесс разделен специфическим разобщающим протеином — термогенином, за счет которого протонный градиент снижается без синтеза АТФ. При этом энергия, высвобождающаяся при окислении субстрата, переходит в тепло, а возвращение свободных протонов в матрикс повышает высвобождение жирных кислот из запасенных триацилглицеридов и увеличивает их уровень в оттекающей от ткани крови.
Термогенин составляет до 15% общего белка митохондрий бурого жира. Молекулярная масса термогенина равна 33,2 кДа. Недавно удалось выяснить аминокислотную последовательность термогенина хомяка. Последовательность термогенина напоминает таковую АТФ/АДФ-антипортера (транслоказы). Как и в случае АТФ/АДФ-антипортера мышечных митохондрий, микромолярные концентрации жирных кислот активируют протонофорную функцию термогенина, что и приводит к разобщению. Термогенин представляет собой монофункциональный вариант АТФ/АДФ-антипортера, утратившего основную (нуклеотид-транспортную) функцию и специализированного на дополнительной функции: разобщении жирными кислотами. Эксперименты, проведенные на животных in vivo, ткани бурого жира in situ, адипоцитах и митохондриях in vitro, позволили выявить следующую цепь событий, включенных в термогенный ответ этой ткани на понижение температуры среды.
1.Холодовые рецепторы кожи активируются и посылают сигнал в мозг, а именно в терморегуляторный центр гипоталамуса.
2.Из гипоталамуса сигнал поступает в бурую жировую ткань через симпатические нейроны. Из нервных окончаний в пространство между адипозоцитами выделяется норадреналин.
3.Норадреналин связывается с β-адренорецепторами, локализованными на внешней стороне плазматической мембраны клеток бурого жира.
4.β-Адренорецепторы, связав норадреналин, активируют аденилатциклазу. Синергистом норадреналина служит глюкагон, а антагонистом — инсулин. Каждый гормон действует через свой рецептор.
5.Аденилатциклаза образует цАМФ из АТФ.
6.цАМФ включает протеинкиназный каскад, приводящий к активации липазы.
7.Липаза расщепляет триацилглицериды, содержащиеся в жировых каплях, до жирных кислот и глицерина.
8.Образованные таким путем жирные кислоты выполняют две функции: они служат субстратами дыхания и одновременно вторичными (внутри-
50