2 курс / Биохимия / Н.Ю.Коневалова - Биохимия

белка, изменяется константа преломления света, и появляется граница раздела фаз. По их числу судят о количестве фракций или об однородности белка.

К этой группе методов относится и гель-фильтрация, использующая полимеры сефадексы, построенные из нитевидных молекул полисахарида декстрана, сшитых через определенные промежутки поперечными связями и свернутых в виде гранул. Образуется молекулярное сито с контролируемым размером отверстий.

Выпускаются марки сефадексов:

G – 200 (пропускают белки с М.м. 200000 Да и <). G – 100 (–//– 100000 Да и <).

G – 75 (–//– 50000 Да и <).

G – 50 (–//– 10000 Да и <).

G – 25 (–//– 4000 Да и <).

Гелем сефадекса заполняют колонку и в нее вводят смесь белков. Сверху постоянно подают ток растворителя. Молекулы, размер которых меньше отверстий, легко диффундируют в гранулы. Под влиянием тока жидкости молекулы выходят из гранул и заходят в следующие. Поэтому молекулы движутся медленнее тока жидкости. Молекулы больших размеров не могут пройти в гранулы, обтекают их и проходят через коло н- ку без задержки. Собирая вытекающую жидкость малыми порциями, можно разделить белки на фракции. Это очень эффективный метод фракционирования веществ.

Белки – заряженные вещества. В зависимости от величины заряда и молекулярной массы они имеют разную скорость передвижения в электрическом поле. На этом основан метод электрофореза. Он проводится в буферном растворе с определенным значением рН (веронал-

мединаловый – рН=8,6). Возможен бумажный электрофорез и в геле:

полиакриламидном, крахмальном. Разделение в гелях более тонкое, так как они играют роль молекулярного сита, а не только опорной среды, т.е. здесь имеют значение величина заряда и величина частиц.

Эффективными методами разделения и идентификации химических соединений, в том числе и белков, являются хроматографические методы. Метод хроматографии был разработан в 1906 году русским ботаником М.С. Цветом, который разделял растительные пигменты. В настоящее время используются четыре основных вида хроматографии:

1)Адсорбционная.

2)Распределительная.

3)Ионообменная.

4)Аффинная

Разработаны различные приемы их применения в зависимости от решаемых задач: от идентификации каких-либо веществ до получения даже больших количеств чистого вещества. Хроматографическое разде-

41

ление веществ может проводиться с использованием разных носителей на колонках (колоночная хроматография), на бумаге (бумажная), в тонком слое сорбента (чаще всего с использованием силикагеля - тонкослойная), газовая.

Адсорбционная хроматография основана на различной полярности веществ и их индивидуальной способности связываться с адсорбентом взаимодействием разного типа.

Распределительная хроматография основана на использовании подвижной и неподвижной (стационарной) фаз, представляющих две несмешивающиеся жидкости, взятые в определенном соотношении. Неподвижная фаза закрепляется на каком-либо твердом инертном носителе, в качестве которого могут использоваться силикагель, целлюлоза, фильтровальная бумага. Через твердый носитель пропускается подвижная фаза. Коэффициент распределения веществ в этих жидкостях (подвижной и неподвижной фазах ) будет разным. Поэтому при пропускании растворителя через колонку с адсорбентом или бумагу с нанесенной смесью разделяемых веществ (стационарная фаза на носителе) в зависимости от распределения в подвижной и неподвижной фазах вещества будут двигаться с разной скоростью, т.е. происходит их разделение.

В целом метод был назван жидкостной хроматографией. При использовании в качестве твердого носителя фильтровальной бумаги хроматография называется бумажной. Это один из наиболее эффективных аналитических методов разделения веществ. Жидкостная распределительная хроматография на бумаге используется для разделения многих типов веществ, включая углеводы, липиды, нуклеотиды, белки, пептиды. Разработаны различные модификации этого метода с использованием разных носителей (окиси алюминия, производных целлюлозы, кремнезема), а также самых разнообразных растворителей. К таким разновидностям относится тонкослойная хроматография, при которой смесь веществ разделяется с помощью восходящей хроматографии на твердом носителе, нанесенном на стеклянную или пластмассовую пластинку.

Другой модификацией распределительной хроматографии является газожидкостная хроматография, особенно пригодная для разделения легко летучих веществ. В этом методе колонка заполняется тонкоизмельченными частицами инертного твердого носителя (например, огнеупорный кирпич), пропитанными нелетучими жидкостями (смазочными или силиконовыми маслами, др.). В колонке по всей длине поддерживается высокая температура (170-2250). Смесь анализируемых летучих веществ вводится в верхнюю часть колонки и быстро там испаряется. Пары веществ проходят через колонку, увлекаемые равномерным потоком инертного газа (азота, аргона, гелия). Компоненты смеси движутся по колонке с разными скоростями в зависимости от коэффициен-

42

тов распределения между газом (подвижная фаза) и нелетучей жидкостью (неподвижная фаза). Наличие разделяемых веществ в потоке газа, выходящего из колонки, обнаруживается физическими или химическими методами. Результаты автоматически записываются на диаграммной ленте в виде серии пиков.

Ионообменная хроматография основана на различиях в приро-

де ионизированных групп белков. Здесь используются ионообменные полимеры на целлюлозной основе, представляющие высокополимерный каркас, химически соединенный с заряженными группами, способными связывать ионы за счет электростатического взаимодействия. Они способны обменивать эти ионы на ионы, содержащиеся в водном растворе. Сшивка цепей в каркасе полимера очень частая, и молекулы белков не могут проникать внутрь полимера, а взаимодействуют лишь на поверхности с ионизированными группами.

Различают катионо- и анионообменники. Примером катионообменников является карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), т.е. целлюлоза, к OH-группам которой пришиты группы –СН2–СООН. При ее обработке щелочью образуется солевая форма –O–CH2–CООNa, в которой катион Na+ может обмениваться на другие катионы, в том числе и белковые. Примером анионообменников является ДЕАЕ – целлюлоза (диэтилами- ноэтил-целлюлоза),

при обработке которой щелочью или кислотой образуется солевая форма, имеющая анион:

Эти анионы могут обмениваться на другие, в том числе и белковые. Разная способность белков связываться с ионообменником зависит от количества и природы заряженных групп в белках. Анионообменники используются для разделения кислых и нейтральных белков, катионообменники – основных.

Элюция белков с ионообменников проводится раствором с высокой концентрацией солей (NaCl). Первыми снимаются белки, обладающие меньшим сродством к ионообменнику, а затем с большим.

Аффинная или хроматография по сродству основана на изби-

рательном взаимодействии белка со специфическими веществами – лигандами, пришитыми к носителю. Роль лиганда могут выполнять субстраты (при выделении ферментов), гормоны, коферменты и др.; в результате высокой специфичности белка к данному лиганду происходит выделение из смеси только данного белка. Элюция белка с носителя

43

полняющих какие-то определенные функции (транспортную, рецепторную, иммунологическую и др.). Это приводит к нарушению конкретных процессов, зависящих от данного неферментного белка. Примерами ферментопатий являются нарушения обмена фенилаланина и тирозина (фенилкетонурия, алкаптонурия, тирозиноз, альбинизм), гликогена (гликогенозы и агликогенозы), галактозы (галактоземия), и других веществ. Классическим примером неферментных протеинопатий являются гемоглобинопатии, связанные с генетическими дефектами субъединиц гемоглобина. Среди них хорошо изучена серповидноклеточная анемия, при которой в крови больных содержится аномальный гемоглобин НbS. Он отличается от нормального гемоглобина НbА тем, что в β- субъединицах вместо отрицательно заряженной глутаминовой кислоты в шестом положении находится валин (гидрофобная аминокислота) вследствие мутации в структурном гене ДНК, кодирующем β- субъединицу гемоглобина. Подобная замена сказывается на физикохимических свойствах молекулы, что проявляется уменьшением растворимости дезоксигемоглобина. Он может выкристаллизовываться в эритроцитах, которые принимают форму серпа (отсюда и название болезни), могут закупоривать капилляры, погибают. Нарушается снабжение тканей кислородом. Распад эритроцитов приводит к анемии (малокровию). Заболевание может привести к неблагоприятному исходу. Протеинопатии могут быть наследственными и приобретенными.

В процессе развития организма – в разные периоды жизни (при онтогенезе) белковый состав также изменяется. Так, у плода имеется Нb F, а после рождения он заменяется на Нb А1.

Лекция 3

ФЕРМЕНТЫ. СТРОЕНИЕ. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

1. Особенности биокатализаторов

Ферменты – это белковые катализаторы биохимических реакций. Между ферментами и неорганическими катализаторами есть сходства и различия (связанные с белковой природой ферментов).

Общие свойства ферментов и неорганических катализаторов:

1.Подчинение закону действующих масс.

2.Не сдвигают подвижного равновесия реакции, т.е. ускоряют как прямую, так и обратную реакцию.

45

3.Влияют только на скорость химических реакций.

4.Выходят из реакции в неизменном виде.

5.Не ускоряют термодинамически невозможных реакций.

Отличия ферментов от неорганических катализаторов:

1.Ферменты действуют в «мягких» условиях внутренней среды организма.

2.Ферменты это белки, поэтому они чувствительны к действию денатурирующих агентов.

3.Высокая эффективность ферментов. (Сравним энергии активации разложения перекиси водорода: спонтанно – 75,2 кДж/моль; а в присутствии катализатора платины – 50,2 кДж/моль; фермента каталазы

–8,3 кДж/моль).

4.Катализаторы всегда проявляют максимальную активность: активность ферментов (Е) зависит от условий в клетке.

5.Катализаторы ускоряют достижение химического равновесия, активируя как прямую, так и обратную реакцию. Каждый отдельный фермент действует аналогично. Однако в живых клетках имеют место полиферментные реакции:

Совокупность ферментов в реальной клетке дает направление обмену веществ, т.е. превращение субстрата А в конечные продукты F или N зависит от набора ферментов 1 или 2 пути превращения.

6.Активность ферментов регулируется на генетическом уровне, а также низкомолекулярными соединениями – эффекторами.

7.Ферменты обладают специфичностью действия.

Специфичность действия ферментов

Различают специфичность по отношению к типу химической реакции, катализируемой ферментом, и специфичность по отношению к субстрату. Эти два вида специфичности присутствуют у каждого

фермента.

Специфичность по отношению к субстрату

Это предпочтительность фермента к субстрату определенной структуры по сравнению с другими субстратами. Различают 4 вида субстратной специфичности:

46

1. Абсолютная – фермент катализирует превращение строго определенного одного субстрата. Например, уреаза расщепляет только мочевину, аргиназа – аргинин.

2. Относительная – фермент катализирует превращение не-

скольких субстратов, имеющих один тип связи. Например, липаза расщепляет сложноэфирную связь между глицерином и любой жирной кислотой в триацилглицеринах.

3. Относительная групповая – фермент катализирует превраще-

ние нескольких субстратов, имеющих один тип связи, но требуются определенные атомные группировки, образующие эту связь. Напри-

мер, все протеолитические ферменты расщепляют пептидную связь, но пепсин – образованную –NH2 группами ароматических аминокислот, химотрипсин – образованную –СООН группами этих же аминокислот, трипсин – пептидную связь, образованную –СООН группой лизина, аргинина.

4. Стереохимическая – фермент катализирует превращение только одного стереоизомера при наличии их смеси. Например, L-оксидаза превращает L-аминокислоту, но не действует на D-изомер.

Специфичность по отношению к реакции

Каждый фермент катализирует одну реакцию или группу реакций одного типа. Часто одно и то же химическое соединение выступает как субстрат для разных ферментов, причем каждый из них, катализируя специфическую для него реакцию, приводит к образованию разных продуктов. Например:

декарбоксилаза

R CH2 + CO2

NH2

Специфичность к типу реакции лежит в основе единой классификации ферментов.

Особенности выделения ферментов

Для выделения ферментов используют методы выделения индивидуального белка. При этом требуются особо щадящие условия. Предпочтителен метод афинной хроматографии (см. лекцию «Методы выделения количественного определения белка»).

47

2. Структурная и функциональная организация ферментов

По строению различают простые ферменты (при гидролизе образуются только аминокислоты) и сложные (при гидролизе образуются аминокислоты и добавочные группы).

Белковая часть фермента называется апофермент, небелковая – кофактор. Прочный природный комплекс апофермента и кофактора – холофермент.

Типы кофактора: а) простетическая группа – прочно связанная с апоферментом небелковая часть, часто связь ковалентная и в качестве небелковой части выступают металлы. б) кофермент – небелковая часть, легко отделяемая от апофермента, рыхло связанная с ним. Часто коферментами служат витамины.

У каждого фермента имеется активный центр.

Активный центр фермента образован: у простых ферментов функциональными группами боковых радикалов аминокислот, сближенных в пространстве. У сложных ферментов: + кофактор.

Примеры функциональных групп активного центра:

NH2–лиз СООН–глу, асп

Участки активного центра:

−Якорный – для фиксации субстрата.

−Каталитический – обеспечивает катализ.

−

Свойства активных центров

1.Это трехмерное образование, в формировании активного центра участвуют функциональные группы аминокислот, линейно далекие друг от друга.

2.На активный центр приходится относительно малая часть общего объема фермента.

3.Активный центр имеет форму узкого углубления или щели, что создает микроокружение, благоприятное для катализа.

4.Субстраты относительно слабо связываются с активным цен-

тром.

5.Специфичность связывания субстрата зависит от строго определенного расположения атомов в активном центре.

У ряда регуляторных ферментов имеется еще один центр – аллостерический. Allos – другой, stereos – пространство, т.е. это центр, за-

нимающий другое пространственное положение, чем активный центр.

48

Присоединение к этому центру низкомолекулярных веществ (эффекторов) ведет к изменению третичной структуры фермента и области активного центра, что приводит к изменению активности фермента.

3. Механизм и стадии ферментативного катализа

Химическая реакция – это результат столкновения молекул, который зависит от величины энергии молекул и от прочности той связи между атомами в молекуле, которая должна быть разорвана. Молекул с очень низкой и очень высокой энергией мало, большинство молекул обладает средним запасом энергии. Они и определяют скорость реакции.

Способы ускорения химических реакций:

1.Увеличить среднюю энергию молекул

2.Снизить энергетический барьер реакции

Энергетический барьер реакции – это значение энергии, когда все молекулы взаимодействуют.

Энергия активации – количество энергии, необходимое для того, чтобы все молекулы смогли провзаимодействовать (преодолеть энергетический барьер).

В общем виде уравнение химической реакции в присутствии фермента можно записать

E + S ↔ ES ↔ EZ → EP → E + P,

где Е – фермент, S – субстрат, Р – продукт, Z – промежуточный комплекс.

Ферментативная реакция протекает в три стадии:

I стадия: E + S ↔ ES – образование фермент-субстратного комплекса. Протекает очень быстро. Субстрат присоединяется к якорному участку активного центра. В 1894 г. Фишер предложил модель взаимодействия фермента с субстратом «ключ-замок», т.е. субстрат подходит к ферменту как ключ к замку. Согласно этой модели у фермента имеет-

ся окончательно сформированный активный центр еще задолго до взаимодействия с субстратом. Эта модель объясняла абсолютную специфичность фермента и не могла объяснить относительной, поэтому Кошланд предложил модель «индуцированного соответствия». Со-

гласно этой модели, окончательное формирование активного центра фермента происходит в момент взаимодействия с субстратом, т.е. при

связывании субстрата с якорным участком активного центра происходит изменение конформации каталитического участка актив-

ного центра, обеспечивающее его комплементарность поверхности субстрата.

49

Причины ускорения реакции на I стадии:

1.Происходит сближение и правильная ориентация молекул субстрата в области активного центра фермента.

2.Это приводит к увеличению эффективной концентрации мо-

лекул субстрата (т.е. тех молекул, которые взаимодействуют), т.к. в растворе без фермента их столкновения были случайны.

II стадия: на стадии фермент-субстратного комплекса происходит химическая реакция через переходное состояние ЕS → EZ, где Z – это уже не субстрат, но еще и не продукт. Именно эта стадия лежит в основе субстратной специфичности фермента. Неспецифические (непродуктивные) взаимодействия субстрата с ферментом нарушаются при образовании переходного состояния, при специфическом взаимодействии на стадии переходного состояния происходит резкое увеличение скорости реакции. На этой стадии происходит ускорение реакции вследствие уменьшения энергии активации.

Причины снижения энергии активации:

1.Фермент передает часть своей энергии субстрату в ходе взаимной подгонки конформации субстрата и фермента. Субстрат в ходе взаимодействия с активным центром фермента деформируется (растягивается на активном центре как на «дыбе» – гипотеза «дыбы»), что облегчает разрыв его связей.

2.Уменьшается энергетический барьер реакции путем разбивки ее на ряд промежуточных стадий, каждая из которых имеет низкий энергетический барьер.

Снижение энергии активации под действием ферментов

P

ЕCР направление

реакции

С ферментом

S

Р

50