4 курс / Дерматовенерология / Розацеа

по 0,05 мл биологического материала без следов гемолиза. В одну из пробирок, служащую контрольной, добавляли по 1,0 мл раствора фтористого натрия с целью инактивации ферментативной активности церулоплазмина. Затем во все пробирки помещали по 4,0 мл ацетатного буфера и по 0,5 мл раствора p-фенилендиамина, используемого в качестве субстрата. Пробирки встряхивали и ставили на 1 ч в водяную баню с температурой 37°С. После инкубации во все пробирки, за исключением контрольной, добавляли по 1,0 мл раствора фтористого натрия. Содержимое пробирок перемешивали и помещали в холодильник на 30 мин. при 4°С. По оптической плотности образующихся продуктов судили об уровне церулоплазмина. Интенсивность окраски оценивали на спектрофотометре «Solar» PV1251C при длине волны 530 нм относительно контрольной пробы. Умножая полученные значения абсорбции на коэффициент 875, находили величину концентрации церулоплазмина в мг.

По результатам определения содержания церулоплазмина в плазме крови выявлено достоверное снижение его у пациентов 1-й

(109,3±5,59 мг/л, p<0,05), 2-й (92,3±5,71 мг/л, p<0,001) и 3-й

(75,9±5,44 мг/л, p<0,001) групп по сравнению с контролем (124,1±4,81 мг/л). Установленное снижение концентрации данного антиоксиданта на фоне утяжеления клинической картины дерматоза позволяет рассматривать уровень церулоплазмина как важный диагностический критерий оценки степени тяжести ППР (рисунок 4.2).

С помощью ROC-анализа установлены точки разделения с учетом приоритета специфичности. Площадь под ROC-кривой, построенной для разделения показателей церулоплазмина при дифференцировке легкой степени тяжести ППР и контрольной группы составила 0,65 (0,53-0,75). Оптимальная точка разделения равнялась 109,3 (чувствительность – 59,5 (43,3-74,7), специфичность

– 65,9 (49,4-79,9)). Площадь под ROC-кривой при дифференцировке легкой и средней степени тяжести ППР составила 0,63 (0,52-0,73). Оптимальная точка разделения равнялась 92,4 (чувствительность – 49,0 (34,4-63,7), специфичность – 59,5 (43,3-74,0)). Площадь под ROC-кривой при дифференцировке средней и тяжелой степени тяжести ППР составила 0,6 (0,5-0,7). Оптимальная точка разделения равнялась 76,0 (чувствительность – 48,7 (31,9-65,6), специфичность –

59,2 (44,2-73,0)).

~ 61 ~

Концентрация α-токоферола в плазме крови пациентов 2-й

(17,0±1,71 мкмоль/л и 15,6±0,71 мкмоль/л, соответственно; p>0,05) групп данный показатель имел тенденцию к повышению, но достоверно не отличался от аналогичного показателя в контрольной группе (рисунок 4.4).

Таким образом, активность СОД, каталазы, концентрации ДК, МДА, восстановленного глутатитона, ретинола и α-токоферола у пациентов с ППР разной степени тяжести не имеет столь выраженных изменений и, стало быть, менее информативна в качестве диагностических критериев, чем другие изучаемые показатели прооксидантно-антиоксидантного статуса (суммарные нитрат/нитриты, церулоплазмин).

~ 64 ~

4.2 Уровень активатора неоангиогенеза – фактора роста эндотелия сосудов и провоспалительных цитокинов – у пациентов с папуло-пустулезной формой розацеа

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является ведущим цитокином при розацеа, стимулирующим вазодилатацию и неоангиогенез. Его гиперпродукция, кроме расширения и формирования новых сосудов, способствует миграции моноцитов с последующей выработкой ряда провоспалительных цитокинов, наиболее значимыми из которых являются ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α.

Для определения концентрации фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в сыворотке крови применялся набор DRG® VEGF для твердофазного меченного ферментом иммуноферментного анализа, основанного на принципе сэндвича в соответствии с инструкцией производителя. Учет результатов проводили с помощью иммуноферментного анализатора «Sunrise» TECAN (Австрия), регистрируя оптическую плотность при длине волны 450 нм и концентрацию содержащихся в образцах VEGF, ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α. Концентрации VEGF, ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α были прямо пропорциональны интенсивности окрашивания.

При изучении уровня VEGF при разной степени тяжести ППР было установлено, что в сыворотке крови у пациентов 1-й

(93,72±4,98 пг/мл, p<0,05), 2-й (107,93±5,03 пг/мл, p<0,001) и 3-й

(122,15±4,5 пг/мл, p<0,001) групп содержание VEGF оказалось достоверно выше по сравнению с контролем (77,81±4,42 пг/мл). С утяжелением клинической картины заболевания концентрация VEGF в сыворотке крови увеличивалась, что подтверждается наличием достоверных различий между 1-й и 2-й (p<0,05), 2-й и 3-й (p<0,05), 1-й и 3-й (p<0,001) группами (рисунок 4.5).

~ 65 ~

равнялась 123,3 (чувствительность – 54,1 (36,9-70,5),

специфичность – 69,4 (54,6-81,7)).

Следовательно, уровень фактора роста эндотелия сосудов VEGF при ППР увеличивается и по мере утяжеления клинической картины заболевания отмечается статистически значимое увеличение его, что в свою очередь свидетельствует о диагностической ценности активатора неоангиогенеза в качестве информативного диагностического теста. Предельные интервалы данного показателя при разной степени тяжести ППР, в частности: при легкой степени тяжести – от 93,7 до 107,8 пг/мл, при средней – от 107,9 до 122,0 пг/мл, при тяжелой – более 122,1 пг/мл.

В плазме крови у пациентов с ППР отмечается увеличение содержания цитокинов провоспалительного профиля (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α) по сравнению со здоровыми лицами. При этом выраженность воспалительного процесса у пациентов с ППР возрастает с утяжелением клинической картины заболевания [103, 104, 166].

Определение уровня цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α) осуществляли путем твердофазного иммуноферментного анализа в плазме крови с помощью стандартных наборов ЗАО «Вектор Бест» (А-8766 ИНТЕРЛЕЙКИН-1бета – ИФА – БЕСТ, А-8768 ИНТЕРЛЕЙКИН-6 – ИФА – БЕСТ, А-8756 альфа-ФНО – ИФА – БЕСТ) в соответствии с инструкцией производителя. Учет результатов проводили с помощью иммуноферментного анализатора «Sunrise» TECAN (Австрия, инв. № 01352090),

регистрируя оптическую плотность при длине волны 450 нм и концентрацию содержащихся в образцах VEGF, ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α. Концентрации VEGF, ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α были прямо пропорциональны интенсивности окрашивания.

При изучении уровней провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α), установлено, что концентрация ИЛ-1β у пациентов с легкой степенью тяжести ППР была достоверно выше аналогичного показателя в контрольной группе (p<0,05). При анализе средних значений изучаемого интерлейкина у пациентов 2-

й (3,98±0,10 пг/мл, p<0,001) и 3-й (4,32±0,12 пг/мл, p<0,001) групп также выявлено его достоверное повышение по сравнению с контролем (3,28±0,13 пг/мл). У пациентов 2-й группы уровень ИЛ1β был достоверно ниже, чем в 1-й, и достоверно выше, чем во 2-й

~ 67 ~

(p<0,05). Кроме того, данный показатель имел достоверные различия между 1-й и 3-й группами (таблица 4.3).

В плазме крови у пациентов с тяжелой степенью тяжести ППР обнаружено достоверное повышение концентрации ИЛ-6 по сравнению с контрольной группой (1,80±0,13 пг/мл и 1,25±0,06 пг/мл соответственно; p<0,001). При оценке аналогичного показателя у пациентов 1-й и 2-й групп достоверных различий не выявлено (p>0,05), однако отмечалась тенденция к его повышению. У пациентов 3-й группы ИЛ-6 был выше в 1,2 раза по сравнению с аналогичным показателем во 2-й (p<0,05), и в 1,3 раза – 1-й группами (p<0,01) (таблица 4.3).

Таблица 4.3. – Уровни ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α в крови у женщин с разной степенью тяжести ППР

Примечания –

1 – * – различия с показателями контрольной группы достоверны (p<0,05);

2 – # – различия между показателями 1-й и 2-й групп, 1-й и 3-й групп достоверны

(p<0,05);

3 – @ – различия между показателями 2-й и 3-й групп достоверны (p<0,05)

Анализ результатов исследования позволил выявить достоверное повышение концентрации ФНО-α в плазме крови у пациентов 1-й (1,71±0,05 пг/мл, p<0,05), 2-й (1,84±0,08 пг/мл, p<0,01) и 3-й (2,21±0,10 пг/мл, p<0,001) групп по сравнению с контролем (1,55±0,04 пг/мл). Вероятно, повышение воспалительной активности, индуцированной ППР, привело к увеличению концентрации ФНО-α. У пациентов с тяжелой степенью тяжести заболевания данный цитокин был выше в 1,2 раза по сравнению с таковым показателем во 2-й (p<0,01) и в 1,3 раза – в 1-й (p<0,001) группах (таблица 4.3). Отмечается закономерность увеличения уровня ФНО-α со степенью тяжести заболевания. Поскольку ФНО- α синтезируется в первой фазе цитокинового выброса, вероятно, изменение его концентрации в крови происходит быстрее, чем

~ 68 ~

более инертного ИЛ-6. Таким образом, выраженность активности воспалительного процесса у пациентов с ППР возрастала с утяжелением клинической картины заболевания.

Таким образом, лабораторными критериями оценки степени тяжести ППР являются: концентрация суммарных нитрат/нитритов и церулоплазмина в плазме крови, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в сыворотке крови.

Заключение. По результатам проведенного исследования нами предлагается использовать следующий комплекс клиниколабораторных данных, позволяющих объективно оценить степень тяжести ППР [38, 44]:

легкая степень – незначительное количество папул/пустул, концентрация суммарных нитрат/нитритов от 11,3 до 12,9 мкмоль/л; концентрация церулоплазмина от 92,4 до 109,3 мг/л; концентрация VEGF от 93,7 до 107,8 пг/мл;

средняя степень – среднее количество папул/пустул, отсутствие бляшек, концентрация суммарных нитрат/нитритов от 13,0 до 14,8 мкмоль/л; концентрация церулоплазмина от 76,0 до 92,3 мг/л; концентрация VEGF от 107,9 до 122,0 пг/мл;

тяжелая степень – большое количество папул/пустул, наличие бляшек, концентрация суммарных нитрат/нитритов более 14,9 мкмоль/л; концентрация церулоплазмина менее 75,9 мг/л; концентрация VEGF более 122,1 пг/мл.

~ 69 ~

Глава 5 ВИДОВОЙ СОСТАВ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ

К АНТИБИОТИКАМ МИКРООРГАНИЗОВ, ИЗОЛИРОВАННЫХ У ПАЦИЕНТОВ

С ПАПУЛО-ПУСТУЛЕЗНОЙ ФОРМОЙ РОЗАЦЕА

Среди факторов, способствующих развитию розацеа и прогрессированию заболевания до папуло-пустулезной формы, выделяют влияние облигатно-патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Учитывая противоречивые данные научной литературы, нами проведено микробиологическое исследование кожных покровов в области локализации пустул, а также содержимого последних с целью установления наличия гноеродных бактерий и определения их чувствительности к антибиотикам.

Забор материала для микробиологического исследования проводили с поверхности кожи площадью 1 см2 в области локализации пустул стерильным тампоном, который помещали в транспортную среду, после чего область кожи обрабатывали 2% водным раствором хлоргексидина и пустулу вскрывали стерильным скарификатором. Содержимое пустул отбирали другим стерильным тампоном. Материал доставляли в бактериологическую лабораторию УЗ «Гродненская областная клиническая больница», где засевали на селективные питательные среды (кровяной агар, желточно-солевой агар, агар Эндо) и культивировали в течение 24 ч при температуре 37оС. Из выросших изолированных колоний готовили мазки, окрашивали по Граму и микроскопировали. Из чистой монокультуры готовили энокулят в стерильном физиологическом растворе и на анализаторе VITEC 2 (Биомерье, Франция) с помощью карт для идентификации грамположительных кокков VITEK 2GP устанавливали вид бактерий. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяли с помощью карт тестирования AST-GP70.

Культуральное исследование проводили всем пациентам 2-й и 3-й групп. Из 86 обследованных гноеродные бактерии в области локализации патологических очагов обнаружены у 76 (88,4±3,5%). При изучении 162 штаммов, изолированных с кожных покровов и

~ 70 ~