5 курс / Инфекционные болезни / Доп. материалы / Биохимические_и_генетические_особенности_реализации_патогенности

51

воздействия стафилококков на клетки НТ-29 осуществляли в трех биологических повторах.

Индукция образования фаговых частиц

S. epidermidis SE36-1 культивировали в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой (Brain Heart Infusion Broth, Oxoid) при 37° С на шейкере-

инкубаторе ES-20 (BioSan) при 110 об/мин в течение 18 часов. Индукцию фаговых частиц инициировали посредством добавления митомицина С до конечной концентрации 0,2 мкг/л с последующей инкубацией в течение 10

часов. Затем проводили центрифугирование (7000 об/мин в течение 20

минут).

2.3 Микроскопические методы

Просвечивающая электронная микроскопия фаговых препаратов Фаговые частицы, содержащиеся в лизате, адсорбировали на углеродную

сетку и контрастировали 1%-фосфорновольфраматом Na, pH 7, в течение 1

мин. Просвечивающая микроскопия осуществлялась на электронном микроскопе JEOL 100CX2.

Приготовление образцов для сканирующей электронной микроскопии Для изучения образования биопленок стафилококки культивировали в 1 мл триптон-соевого бульона в культуральных планшетах на 24 лунки

(Greinerbio-one, Ltd.), содержащих в каждой лунке покровные стекла размером 0,5 х 0,5 см. Инокулят вносили до конечной плотности бактериальной суспензии 0,5 MF. Инкубацию проводили при 37° С в аэробных условиях в течение 24 и 48 часов, после чего покровные стекла промывали двукратно стерильным раствором 0,9% NaCl и извлекали из планшета. Образцы фиксировали 10 % раствором нейтрального формалина.

При совместном культивировании стафилококков и клеток НТ-29

осуществляли визуальное наблюдение их взаимодействия. Клетки HT-29

выращивали в культуральном планшете с покровными стеклами, как описано

Рекомендовано к изучению разделом по микробиологии сайта https://meduniver.com/

53

Амплификация фрагментов генов В ходе работы проводилась амплификация ряда генов «домашнего

хозяйства»: для S. epidermidis-arcC, aroE, gtr, mutS, pyrR, tpiA, ygiL; для S. haemolyticus-arcC, aroE, cfxE, gmk, gtr, hemH, leuB, mvaK, mutS, pta, pyrR, riboseABCD, rphE, sh1200, sh1431,tphK, tpi, ygi. Последовательности праймеров, использованных для постановки реакции амплификации указанных генов представлены в таблице 5. Амплификацию проводили в 25

мкл реакционной смеси, содержащей 66 мМ Tris-HCl (рН 9,0), 16,6 мМ

(NH4)2SO4, 2,5 мМ MgCl2, 250 мкМ каждого dNTP, 1ед. Taq ДНК полимеразы

(ООО НПФ Литех, Россия), по 10 пмоль соответствующих праймеров.

Реакцию проводили на TETRAD DNA ENGINE (MJ Research, Inc.) при 94oC 2

мин, далее 35 циклов: 94oC 30 сек, 58 oC 30 сек ,72 oC 30 сек. Продукты амплификации анализировали в 2 % агарозном геле с визуализацией бромистым этидием.

Полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили с использованием IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) и CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Данные анализировали с помощью программного обеспечения CFX Manager (Bio-Rad). Праймеры подбирали с помощью программного обеспечения Oligo 6.71 (Molecular Biology Insights,

Inc., Cascade, США). Используемые праймеры представлены в таблице 5.

Эксперименты проводили в трех биологических и трех технических повторах.

Таблица 5. Последовательности праймеров, использованных для

постановки реакции амплификации

Выявление факторов вирулентности и патогенности стафилококков

MLST изолятов S. epidermidis

Рекомендовано к изучению разделом по микробиологии сайта https://meduniver.com/

55

Рекомендовано к изучению разделом по микробиологии сайта https://meduniver.com/

57

Рекомендовано к изучению разделом по микробиологии сайта https://meduniver.com/

59

ходе реакции амплификации, обрабатывали щелочной фосфатазой арктических креветок и экзонуклеазой I E. coli (ExoI) для инактивации неизрасходованных нуклеотидов и деградации олигонуклеотидных праймеров. Для этого к полученным ампликонам добавляли по 5 мкл смеси,

содержащей 66 мМ Tris-HCl pH 9,0; 16,6 мM (NH4)2SO4; 2,5 мM MgCl2, 5 ед.

ExoI (Fermentas, Литва), и 0,5 ед. щелочной фосфатазы арктических креветок

(Fermentas, Литва). Инкубировали в течение 20 минут при 37° С с последующей инактивацией ферментов прогреванием в течение 10 минут при

85° С.

Определение нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов ДНК проводили модифицированным методом Сенгера с использованием ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready

Reaction Kit и прибора ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems,

США) в соответствии с прилагаемыми инструкциями.

Поиск гомологичных последовательностей проводили в GenBank [156],

используя алгоритм BLAST [157].

Мультилокусное секвенирование-типирование (MLST)

Типирование изолятов КОС проводилось с помощью метода MLST. MLST для вида S.epidermidis было проведено на основании общепринятой схемы [138]. Данная схема включает анализ нуклеотидных последовательностей 7 участков генов «домашнего хозяйства», а именно: arcC, aroE, gtr, mutS, pyrR, tpiA, ygiL. Для вида S. haemolyticus нет апробированной схемы MLST. Поэтому был проведен анализ кандидатных генов «домашнего хозяйства» (mvaK, rphE, tphK, gtr, arcC, tpi, aroE, pta, и

др.). Амплификация и определение нуклеотидных последовательностей генов

«домашнего хозяйства» проводилось с использованием методов, описанных выше.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участков генов «домашнего хозяйства», был проведен с использованием следующего

Рекомендовано к изучению разделом по микробиологии сайта https://meduniver.com/