5 курс / Инфекционные болезни / Доп. материалы / Патогенез,_диагностика_и_терапия_урогенитального_хламидиоза_Исаков

Глава 2. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

При обследовании в 1997–2003 гг. (Чехия) методом ПИФ 6126 об разцов от пациентов на хламидиоз лишь в 14,4 % были получены пози тивные результаты (Förstl M. et al., 2005). Среди них 14,1 % позитивных результатов — в мочеполовом тракте у женщин и 15,2 % у мужчин, 14,1 % — из конъюнктивальных образцов и 3,7 % из нижнего респи раторного тракта. С учетом деления пациентов по возрасту на деся тилетия позитивные результаты у женщин составили 0–13–14,4–13,9– 13,9 %, а в возрасте свыше 60 лет — 13,9 %. У мужчин соответственно 0–21,4–15,1–16–13,4 %, в возрасте свыше 60 лет — 16 %, т. е. максималь ное количество позитивных результатов было выявлено в образцах от мужчин в возрасте 20–30 лет, что в два раза выше по сравнению с жен щинами того же возраста. Вывод: ПИФ может применяться для обнаружения C. trachomatis, однако для контроля или подтверждения спорных данных необходимо применение второго метода, например ПЦР.

Проведено сравнение эффективности трех методов диагностики хламидийной инфекции: ПЦР, прямой иммунофлюоресценции и ИФА (Arustamian K. K., 2006). Оценивали чувствительность, специфичность, положительные и негативные предсказательные параметры для каждо го из этих методов, обследовав образцы цервикального соскоба и кро ви от 103 женщин репродуктивного возраста. Обнаружено, что ПЦР имел высокую чувствительность (92,1 %) и специфичность (95 %) и был высокоэффективен в диагностике УГХ. Позитивные результаты ПЦР из цервикальных соскобов служат надежным доказательством присут ствия хламидийной инфекции, в то время как негативные ПЦР данные не свидетельствуют об отсутствии инфекции во внутренних половых органах женщин с бесплодием. Следовательно, при диагностике УГХ у женщин репродуктивного возраста рекомендуется одновременное ис пользование двух диагностических методов (Arustamian K. K., 2006).

Реакция иммунофлюоресценции в последнее время широко приме­ няется в России. Согласно приказу МЗ РФ № 286 от 07.12.93 «О совер­ шенствовании контроля за заболеваниями, передающимися поло вым путем»,­ этот метод рекомендован в качестве основного метода диагностики­ хламидиоза в условиях практического здравоохранения

31

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

(Лобзин Ю. В. и др., 2003; Полещук Н. Н. и др., 2003; Сельков С. А. и др., 2001). В то же время­ в практике здравоохранения ряда стран для поста новки диагноза хла­мидиоза требуется подтверждение результата куль туральным или иным методом, что связано со значительным риском гипердиагностики (Skolnik N., 1995; CDC, 2002, 2006).

Методы ИФА основаны на обнаружении растворимого АГ хлами дий в исследуемых клинических пробах (VIDAS Chlamidia, BioMerieux, Франция;­ Pathfinder® Chlamydia Microplate, Sanofi Diagnostics Pasteur, Франция;­ Chlamydia Ag EIA KIT, Labsystem, Финляндия). Для про ведения теста­ используют преимущественно наборы реактивов Chlamydiazyme лаборатории­ фирмы Abbott (США) и Chlamydia-antigen ELISA фирмы Medac Diagnostica (Германия), основанные на методе твер дофазного иммуноферментного анализа для определения АГ хламидий (Савичева A. M. и др., 1998; 2002). Чувствительность и специфичность­ ИФА, по данным разных авторов, составляет соответственно 65–78 и 100 % (Chernesky M. A. et al., 2004). Важно отметить, что отдельные мо дификации ИФА, например VIDAS Chlamidia, позволяют использовать мочу в качестве исследуемого материала. В случаях высокого содержа ния антигена совпадение­ результата с культуральным исследованием, по данным некоторых­ авторов, составляет более 90 %. Вместе с тем при низком содержании­ антигена (количества инфекционных единиц) чув ствительность метода резко снижается до 60 % и ниже (Кутлин А. В. и др., 1996).

Для диагностики Chlamydia trachomatis предлагается использовать новый автоматизированный метод для подготовки образцов мочи BUGS'n BEADStrade mark STI (BnB STI), после которого применяли ко нечный анализ BDProbeTectrade mark ET и сравнивали его с полным анализом BDProbeTectrade mark ET для выявления C. trachomatis в 1002 образцах мочи. Система BnB STI представляет собою новую концепцию при приготовлении образцов с использованием магнитов, когда снача ла бактерии выделяются из материала, полученного от пациента, после чего происходит очистка нуклеиновых кислот возбудителя с примене нием магнитных бус. Применение обоих методов дало сходную чув

32

Глава 2. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

ствительностсь и специфичность. Использование метода BnB STI для подготовки образцов не препятствовало проведению BDProbeTectrade mark ET теста, тогда как применение подготовки ДНК BDProbeTectrade mark ET вручную в 1,8 % случаев делало невозможным дальнейшее проведение теста. Новый автоматизированный метод для выделения Chlamydia trachomatis из анализов мочи позволяет избегать спорных данных и повышает ошибкоустойчивость систем амплификации ну клеиновых кислот (d'Auriac M. A. et al., 2007).

Удобны для практического применения иммунохроматографические технологии. Такие тест системы разработаны английской фир мой Unipath и позднее французской фирмой Veda Lab. Сущ­ность метода состоит в том, что при внесении в специальный планшет об разца клинического материала, предположительно содержащего ан­ тигены С. trachomatis, происходит взаимодействие с моноклональными антителами, ковалентно связанными с цветным латексом. Комплекс антиген—антитело—латекс движется по полоске нитроцеллюлозного фильтра, постепенно формируя окрашенную зону в случае положи­ тельного результата. Продолжительность исследования всего около 30 минут. При необходимости он может быть реализован в кабинете ле­ чащего врача. По оценкам фирмы Unipath, выпускаемая ими система Clearview Chlamidia MF характеризуется чувствительностью в 77,8 % случаев, специфичностью — в 97,5 %, прогностической значимостью положительных­ результатов — в 86,6 %, прогностической значимостью отрицательных­ результатов — в 95,4 % по сравнению с культуральным методом. Борисов Л. Б. (2001) оценивает чувствительность этого­ мето да в 80 %, а специфичность — 100 %. По данным Скрипкина Ю. К. и со авт. (1996), эффективность иммунохроматографического метода ниже, чем у ПЦР и РИФ: результаты теста Clearview и ПЦР совпадали в 75 % случаев, Clearview и РИФ — в 89 %, Chlamy-Chec-1 (Франция) и РИФ — в 60 %. Другим недостатком иммунохроматографических методов яв­ ляется высокая стоимость диагностических наборов.

Большое внимание уделяют серологическим методам диагно стики хламидиоза, которые позволяют свести к минимуму число

33

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

ложноотрицательных результатов, особенно в случаях хронической­ персистирующей инфекции, когда отсутствует возбудитель в пер­ вичном очаге, а материал из внутренних половых органов недоступен для исследования (Анкирская А. С., 1999). Выявление персистирующих форм хламидий прямыми методами может быть затруднено из за уменьшения­ экспрессии хламидийных МОМР и ЛПС у этих форм бак терий. Трудности культурального выделения­ хламидий из поражен ных тканей, которые наблюдаются даже при выраженных клинических симптомах, могут соответствовать ситуации in vitro, когда хламидии персистируют в виде аномальных неинфекционных форм (Budai I, 2007). Отсутствие типичных включений в подобных случаях, при ко торых страдает идентификация ЛПС патогена с использованием МФА, по видимому, принимается за отрицатель­ный результат культуральной диагностики. Показано, что при болезни Рейтера типичные включе ния, содержащие хламидии, обнаруживались только в 3 случаях, в то время как у 26 из 42 больных присутствовали мелкие цитоплазматиче ские «мелковакуолярные» включения, характерные­ для непермиссив ных условий размножения при персистенции возбудителя­ (Шубин С. В. и др., 1986). Мелковакуолярные включения морфологически иден тичны включениям, наблюдаемым при персистенции хламидий in vitro (Орлова О. Е. и др., 1986). Первичное заражение клеток культуры L929 материалом от больных с длительным хроническим течением хлами диоза со скудной клинической симптоматикой или бессимптомным течением приводит к появлению мелковакуолярных включений, рас положенных на периферии клеток и в течение 48 часов не трансформи рующихся в перинуклеарную зону. Интересно, что у большинства боль ных, у которых выделены мелковакуолярные включения, присутствуют характерные изменения иммунного статуса при бессимптомном или малосимптомном течении заболевания (Гомберг М. А. и др., 1996).

Многие авторы предполагают, что для диагностики латентных форм хламидийной инфекции, а также клинических форм, при которых очаг инфекции локализован в местах, недоступных для взятия материа ла, перспективно­ применение серодиагностики. Так, при диагностике

34

Глава 2. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

бессимптомно­ протекающих сальпингитов хламидии не обнаружили в соскобе цервикального канала с помощью культурального метода и методов, основанных на определении АГ. Однако у этих больных из ткани­ маточных труб возбудитель был выделен, причем одновременно у них отмечался высокий титр антихламидийных AT (Сельков С. А. и др., 2001; Кубанова А. А. и др., 2004; Кухтинова Н. В. и др., 2004). В ис следовании Chernesky M. и соавторов (1998) при сравнении 53 биопсий эндометрия методом ПЦР в 14 случаях был получен положительный­ результат, тогда как при исследовании цервикальных соскобов куль туральным методом хламидии были выявлены только в 4 случаях (ис следование цервикальных проб методом ПЦР не проводилось). Име­ ются данные о том, что при хламидийной инфекции с патологическим процессом в маточных трубах цервикальные культуры неадекватно от­ ражают состояние трубной инфекции. Обсеменение хламидиями сли­ зистой оболочки трубы при отсутствии возбудителя в цервикальном канале возможно при отсутствии клинических симптомов и лапарос­ копических данных за активную инфекцию. По данным Cohenm C. R. (2000), распространенность ДНК хламидий в цервикальном канале у бесплодных женщин достаточно низкая. Напротив, у 30–60 % данного контингента женщин определяются IgG в сыворотке крови, свидетель ствующие о хламидийной инфекции. Делается­ вывод о том, что спустя несколько лет после заражения хламидийной инфекцией жизнеспособ ные микроорганизмы могут все еще присутствовать в верхнем половом тракте. С применением методов лапароскопии­ были получены данные об отсутствии соответствия спектра патогенов в маточных трубах и в цервикальном канале, поэтому специфические серологические тесты (IgG, IgA), независимые­ от местонахождения хламидий, могут служить единственным маркером активной инфекции (Chemesky M., 1997).

При определении ЛПС хламидий с помощью ИФА (ELISA) в перито неальной жидкости в пространстве Дугласа и в цервикальном канале 10 женщин из 60 имели только положительный тест по перитонеальной жидкости, у 2 — положительный цервикальный и отрицательный пе ритонеальный тест; у одной — положительные оба теста. Есть данные

35

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

о том, что при обследовании в ПЦР частей труб после сальпингоэкто мии по причине внематочной беременности не было ни одного случая обнаружения возбудителя в указанных пробах. Однако у нескольких женщин в период за 3 года до эктопической беременности обнаружива лись хламидии во внутриматочных и цервикальных экземплярах. При сравнительном исследовании серологического IgM-теста, ДНК и WIF внутриматочных биопсий и цервикальных проб определена целесоо бразность использования серологии для установле­ния диагноза из за несоответствия обсемененности возбудителем цервикального канала и внутренних половых органов (Chernesky M., 1997).

Имеются данные о негативации прямых лабораторных тестов при хронизации инфекции, причем­ предполагается при этом само произвольная элиминация возбудителя­ (Земсков А. М. и др., 2001; Сельков С. А. и др., 2001). Однако при более продолжительном­ наблю дении у 35 % мужчин после так называемого «спонтанного­ излечения» через некоторое время появлялись симптомы заболевания,­ что по служило поводом предполагать не элиминацию патогена, а превраще ние инфекции в персистентную форму, особенно после проведенного неадекватного лечения. Имеются другие наблюдения об исчезновении хламидий из первичных половых путей при отсутствии лечения, но без элиминации возбудителя (Geisler W. M. et al., 2007).

Наиболее часто сегодня для серодиагностики хламидийной инфек ции используются различные модификации ИФА. Для этих целей ис­ пользуются диагностические наборы фирм Medac Diagnostica (Герма­ ния), Labsystems (Финляндия), Orgenics (Франция—Израиль) и другие. В зависимости от типа тест-системы возможно как определение суммар­ ных антител, так и их дифференциация на классы: IgA, IgM, IgG. При острой инфекции диагностическое значение имеет обнаружение хла мидийных IgM или IgA либо установление конверсии IgG-антител при их нарастании в 2–4 и более раз. Отдельные авторы считают, что по результатам серологических исследований сложно сделать вывод о нали чии активной хламидийной инфекции, так как антитела появляются не сразу после инфицирования, их колебания не всегда коррелируют с кли

36

Глава 2. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

ническим статусом больного, могут сохраняться длительное время по сле эрадикации C. trachomatis. Это обстоятельство лишает данный метод юридической силы. Применение может носить лишь вспомогательный или дополнительный характер. Но возможно использование данного метода при одновременном исследовании к родоспецифическому ЛПС C. trachomatis и БТШ 60 (HSP 60) хламидий (Бойцов А. Г., 2002).

2.2. Культуральный метод

Во многих лабораториях мира начиная с 1965 года для выделения хламидий начали использовать метод культуры клеток. Наибольшая чувствительность­ метода по сравнению с другими применяемы ми на то время методами была отмечена многими исследователями (Савичева А. М. и др., 1998; Полищук Н. Н. и др., 2003; Skolnik N., 1995). На протяжении долгого­ времени культуральный метод был об щепризнанным «золотым стандартом­». III Европейское совещание по хламидиям (2000) пересмотрело этот вопрос, так как многие исследо ватели указывали на положительные результаты ИФА и ПИФ при от рицательном результате культурального метода. Это может быть свя зано с присутствием в материале­ некультивируемых форм хламидий. Сегодня в качестве «золотого стандарта» рекомендуется использовать сочетание культурального метода и методов генной диагностики, то есть подтверждать отрицательный­ результат культурального метода с помощью ПЦР, ЛЦР или рибосомальной РНК амплификации (ТМА — «transcription-mediated- amplification»).

Для выделения хламидий чаще всего используют культуру­ кле ток McCoy, культуру мышиных фибробластов L-929 или HeLa-229. Эффективность метода увеличилась при использовании обработки клеточных культур (L-929, McCoy, HeLa-229) циклогексимидом и цен трифугирования инокулята на монослой (Ozanne G., 1981). Метод выде ления хламидий на культуре клеток­ высокочувствителен и специфичен. Однако были отмечены пределы­ чувствительности данного метода: он не позволяет установить диагноз­ примерно у 10–15 % больных мужчин

37

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

с хламидийной инфекцией уретры и у 20–25 % женщин с хламидийны ми цервицитами (Дмитриев Г. А., 2003). Главными достоинствами куль турального метода диагностики являются­ высокая эффективность, спе­ цифичность, возможность определения­ чувствительности выделенной культуры к антимикробным препаратам­. Его недостатками являются техническая сложность поддержания­ клеточных линий, трудоемкость метода и получение результатов на 3–7-е сутки. В связи с вышеизло женным его реализация невозможна в большинстве учреждений прак тического здравоохранения.

2.3. Молекулярно-биологические методы

Успехи в области молекулярной биологии привели к появлению­ ме тодов, основанных на определении специфических для С. trachomatis последовательностей олигонуклеотидов ДНК или рибосомальной РНК. Первым был апробирован метод ДНК-гибридизации (Palva A. et al., 1987). ДНК-гибридизация in situ, использованная для исследования­ цервикальных и ректальных соскобов, была сходна по результатам­ с за ражением клеточных культур. В последние­ годы тесты амплификации нуклеиновых кислот (ТАНК), к кото­рым относятся полимеразная цеп ная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (ЛЦР), методы SDA (single strand displacement), TMA (transcript-mediated assay) — транскрипцион ная амплификация (ТА), доказали свое превосходство над более ранни ми тестами­ по степени чувствительности. Кроме того, в стадии разра ботки находятся такие методы молекулярной амплификации, как метод с применением Q-репликазы, копирующей РНК-матрицу микробов, и метод усиления сигнала с использованием ДНК.

В основе ЛЦР лежит лигирование олигонуклеотидов, комплемен тарных определенной ДНК-мишени. В методе используется способ ность ДНК-лигазы соединять две пары комплементарных олигонуклео тидов после их гибридизации с последовательностями мишени in vitro. Может применяться для анализа уретральных, эндоцервикальных об разцов и проб мочи. Ряд авторов отмечают, что ЛЦР по специфично

38

Глава 2. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

сти может превосходить ПЦР для диагностики урогенитальной хлами дийной инфекции (Кротов С. А и др., 1998; Тэйлор-Робинсон Д., 1998; Шалепо К. В. и др., 2001; Чураков А. А. и др., 2005).

Транскрипционная амплификация основана на применении ампли фикации посредством транскрипции и гибридизационной защиты (ГЗ) для определения рибосомной РНК C. trachomatis в уретральных (эндо цервикальных) образцах и пробах мочи у мужчин и женщин. К недо статкам метода относят высокую стоимость, необходимость специаль ного оборудования и специальных помещений, качественную оценку, которая определяет только наличие или отсутствие возбудителя, боль шой риск загрязнений между образцами и реагентами (Мавров И. И., 2002; Тихомиров А. Л., Сарсания С. И., 2005).

Наиболее часто для диагностики хламидиоза в нашей стране сей час используется ПЦР. Разными авторами для постановки этой реак ции были предложены разные праймеры. Наиболее известные из них: праймеры с нуклеотидными последовательностями, комплементарны ми гену, определяющему­ структуру большого белка внешней мембра ны (ОМР1), праймеры к гену 165 рибосомальной РНК и праймеры, комплементарные­ гену специфической криптической плазмиды хлами дий. Из них более­ эффективными для диагностики хламидиоза явля ются праймеры к криптической плазмиде (Trum J. W., 2000).

Главным достоинством методов генной диагностики является высо­ кая чувствительность. Тестирование in vitro различных разведений штаммов С. trachomatis показывает, что амплификационные методы дают положительный результат при наличии от 1 до 10 микроорганиз­ мов, культуральный метод — от 5 до 100, метод флюоресцирующих антител­ — от 10 до 500, ДНК-гибридизации — от 500 до 10 тысяч, методы определения антигенов — от 5 до 100 тысяч (Majchrzak M. J., Stanczak G. P., 2005). ПЦР-диагностика позволяет определить возбу дителя заболевания независимо от места локализации инфекционного процесса, а также выявить патоген в период так называемого «серо логического окна» — т. е. в промежутке между моментом инфициро вания организма и появления антител в определяемых количествах.

39

Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза

В последние годы для определения активности хламидийного процесса довольно успешно начали применять ПЦР в режиме реального вре мени — real-time ПЦР (РТ-ПЦР) (Херсонская А. М., 2007; Bustin S. А., 2000; Zhang W. еt al., 2002; Storm M. et al., 2005). Метод РТ-ПЦР под разумевает одновременное проведение двух процессов — собственно ПЦР и детекцию ДНК при помощи флюоресцентных зондов.

Можно выделить наиболее важные направления развития ПЦРлабораторий:

—упрощение процедуры анализа;

—сокращение времени исследования;

—снижение риска контаминации.

Существуют 4 метода детекции результатов ПЦР: гель-фильтрация, гибридизационно-ферментный анализ (ГиФА), флюоресцентная де текция результатов после проведения реакции (FLASH) и флюо ресцентная детекция во время проведения реакции (Real-Time PCR) (Херсонская А. М., 2007; Bustin S. A., 2000). Оптимальными для ла боратории являются флюоресцентные методы, детекция результатов амплификации производится с помощью измерения флюоресценции в закрытой пробирке, что минимизирует вероятность контаминации. Целесообразно использовать ТР-ПЦР для количественной оценки воз будителя при выборе противовирусной терапии (Херсонская А. М., 2007).

Предлагается новый количественный РТ-ПЦР (real-time) метод для обнаружения ДНК C. trachomatis на основе дуплексного праймера Скорпион (Xia Q. F. et al., 2007). Наиболее важной особенностью ме тода являются внутримолекулярные контакты между зондом и ДНКмишенью. Показана высокая чувствительность (количественная дина мическая шкала от 25 до 109 геномных копий на реакционную смесь), специфичность, воспроизводимость внутри одного и разных экспери ментов. Система Скорпион (США) способна достоверно обнаружить искомую ДНК в 98,6 % без проведения повторных тестов. Авторы об следовали системой Скорпион 81 позитивный и 67 негативных образ цов, которые ранее были верифицированы стандартной тест системой

40