6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

M.bovis и M.bovis BCG естественно устойчивы к пиразинамиду из-за мутации в His169>Asp кодоне гена pncA. Замена привела к потере пиразинамидазы, которая гидролизует пиразинамид до активной формы PoA.

У M.tuberculosis были зафиксированы мутации в гене pncA (Cys138>Ser; Gln141>Pro;Asp63>His; делеция G в 162 в 288 кодонах), приводящие к устойчивости к пиразинамиду. Мутации в pncA встречаются у 72–97% пиразинамид-устойчивых штаммов МБТ.

Этамбутол (1 ряд). Этамбутол – противотуберкулезный препарат первой линии с широким спектром активности, как изониазид. Введение этамбутола повышает проницаемость микобактериальной клеточной стенки и увеличивает проникновение в клетку других противотуберкулезных препаратов. Для клеточной стенки МБТ необходимо формирование комплекса миколовых кислот с арабиногалактаном. В синтезе этого комплекса играет роль фермент арабинозилтрансфераза, продукт генов embC, embA и embB.

Арабинозилтрансфераза является мишенью для этамбутола. Связывание этамбутола с ферментом ингибирует перенос арабинозилов к клеточной стенке, что угнетает формирование миколил- арабиногалактан-пептидогликанового комплекса. Это вызывает повышение проницаемости клеточной стенки МБТ.

Наиболее часто у этамбутол-резистентных штаммов обнаруживаются мутации в кодоне 306 гена embB и 406 кодоне гена embB. Однако в недавних работах было обнаружено, что некоторые этам- бутол-чувствительные штаммы имеют мутации в 306 кодоне гена embB. Были предприняты попытки объяснить несоответствие лабораторными ошибками, неадекватными группами контроля или наличием неизвестных механизмов чувствительности микроорганизма к препарату, активирующегося при воздействии других лекарственных средств

Стрептомицин (1 ряд). Стрептомицин, так же, как и целый ряд препаратов: аминогликозиды, макролиды, тетрациклины, виомицин, капреомицин, ингибирует белковый синтез в клетке. Для всех бактерий развитие стрептомицин-устойчивости связано с модификацией стрептомицина с помощью фермента аминогликозидацетилазы. У МБТ такой механизм отсутствует. У МБТ устойчивость к стептомицину связана с мутациями в двух генах:

–rpsL, кодирующем S12 рибосомальный белок

–rrs, кодирующем 16S рибосомальную РНК.

Также предполагается роль повышения проницаемости клеточной мембраны МБТ

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Фторхинолоны (2 ряд). Фторхинолоны используются как препараты второго ряда при МЛУ-туберкулезе. Мишенью для фторхинолонов в клетке является ДНК-гираза. ДНК-гираза является гетеротетрамером (А2В2) и кодируется генами gyrA и gyrB соответственно. ДНК-гираза разрезает двойную нить ДНК. Фторхинолоны связываются с ДНК-гиразой. Точный механизм ингибиции гиразной активности с помощью фторхинолонов дискутируется. Существует предположение, что фторхинолоны связываются не с гиразой, а с разделенной однонитевой ДНК. Комплекс ДНКфторхинолоны препятствует обратному соединению двух нитей ДНК, что приводит к нарушению процессов репликации и транскрипции.

Альтернативный механизм развития устойчивости, связанный с мутациями в гене nor, кодирующем efflux белок, функция которого состоит в активном помповом удалении фторхинолонов из клетки. Такой механизм предполагается у штаммов МБТ, имеющих низкий уровень резистентности к фторхинолонам.

Амикацин/канамицин и капреомицин/виомицин (2 ряд). Относятся к группе аминогликозидов и циклических пептидов, соответственно. По механизму действия сходны со стрептомицином – блокируют синтез белка за счет взаимодействия с малой субъединицей рибосомы. Устойчивость к этим препаратам связывают с точечными мутациями в гене 16S РНК (rrs) в позициях 1400, 1401, 1402 и 1484. Предполагается также, что к устойчивости к капреомицину могут приводить точечные мутации в гене рРНК-метил- трансферазы (tlyA)

Другие противотуберкулезные препараты 2-го ряда

Механизмы действия, а также механизмы формирования устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам второго ряда (ПАСК, циклосерин, этионамид) пока изучены не достаточно. Предполагается, что циклосерин и этионамид ингибируют функции ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки микобактерий, а ПАСК нарушает процессы синтеза фолиевой кислоты и клеточного транспорта. Генетические детерминанты устойчивости к данным препаратам пока не установлены.

Заключительная часть (5 мин)

Современные молекулярно-генетические исследования показывают необходимость применения быстрых тестов в клинике ле- карственно-устойчивого туберкулеза.

Определение мутаций в геноме МБТ может обеспечить важной информацией по лекарственной устойчивости, уровню резистентности и перекрестной устойчивости гомологичных препаратов.

Рекомендуемая литература

1.Ahmad S., Jaber A.A., Mokaddas E. Frequency of embB codon 306 mutations in ethambutol-susceptible and -resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates in Kuwait// Tuberculosis. – 2007. – Vol. 87. – P. 123–129.

2.Cows M., Drobniewski F. Molecular techniques in the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis and the detection of drug resistance. – 2003.

3.Gale, E.F., E. Cundliffe, P.E. Reynolds, M.H. Richmond, and M.J. Waring. 1981. The molecular basis of antibiotic action. John Wiley & Sons, Inc., New York.

4.Garvin R. T., Biswas D. K., Gorini L. The effects of streptomycin or dihydrostreptomycin binding to 16S rRNA or to 30S ribosomal subunits // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1974. – Vol. 71. – P. 3814– 3818.

5.Guillemin V., Jarlier V., Cambau E. Correlation between quinolone susceptibility patterns and sequences in the A and B subunits of DNA gyrase in mycobacteria// Antimicrob. Agents Chemother. – 1998. – Vol. 42. – P. 2084–2088.

6.Maus C. E., Plikaytis B. B., Shinnick T. Molecular Analysis of CrossResistance to Capreomycin, Kanamycin, Amikacin, and Viomycin in Mycobacterium tuberculosis// Antimicrob. Agents Chemother. – 2005. – Vol. 49. – P. 3192–3197.

7.Maus C.E., Plikaytis B.B., Shinnick T.M. Mutation of tlyA confers capreomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis// Antimicrob. Agents Chemother. – 2005. – Vol. 49. – P. 571–577.

8.Miesel L., Rozwarski D.A., Sacchettini J.C., Jacobs Jr. W. R. Mechanisms for isoniazid action and resistance// Novartis Found Symp. – 1998. – Vol. 217. – P. 209–221.

9.Mokrousov I., Narvskaya O., Limeschenko E., Otten T., Vyshnevskiy B. Detection of ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis

strains by multiplex Allele-Specific PCR assay targeting embB306 mutations// J. Clin. Microb. – 2002. – Vol. 40. – P. 1617–1720.

10.Quemard A., Sacchettini J. C., Dessen A., Vilcheze C., Bittman R., Jacobs Jr. W. R., Blanchard J. S. Enzymatic characterization of the target for isoniazid in Mycobacterium tuberculosis// Biochemistry. – 1995. – Vol. 34. – P. 8235–8241.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

11.Rattan A., Kalia A., Ahmad N. Multing-Resistant Mycobacterium tuberculosis: Molecular Perspectives. 1998.

12.Samoskovi A., Parsons L., Salfinger M. The molecular basis of resistance to isoniazid, rifampin, and pyrazinamide in Mycobacterium tuberculosis. 2001.

13.Scorpio A., Zhang Y. Mutations in pncA, a gene encoding pyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculous drug pyrazinamide in tubercle bacillus // Nat. Med. – 1996. – Vol. 2. – P. 662–667.

14.Sreevatsan S., Stochbauer K.E., Pan. X, Kreiswirth B.N., Moghazeh S., Jacobs W., Telenti A., Musser J Ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis: critical role of embB mutations // Antimicrob. Agents Chemother. – 1997. – Vol. 41. – P. 1677–1681.

15.Telenti A., Imboden P., Marchesi F., Matter L., Schopfer K., Bodmer T., Lowrie D., Colston M. J., ColeS. Detection of rifampicin-resis- tance mutations in Mycobacterium tuberculosis // Lancet. – 1993. – Vol. 341 (8846). – P. 647–651.

16.Van Soolingen D., de Haas P. E., van Doorn H. R., Kuijper E., Rinder H., Borgdorff M.W. Mutations at amino acid positio№ 315 of the katG gene are associated with high-level resistance to isoniazid, other drug resistance, and successful transmission of Mycobacterium tuberculosis in the Netherlands // J. Infect. Dis. – 2000. – Vol. 182.

– P. 1788–1790.

17.Zhang Y., Heym B., Allen B., Young D., Cole S. The catalase-per- oxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis // Nature. – 1992. – Vol. 358. – P. 591–593.

18.Zhang Y., Mitchison D. The curious characteristics of pyrazinamide: a review // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. – 2003. – Vol. 7. – P. 6–21.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационная системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

Тема 11.2. «Молекулярно-генетические методы определения ЛУ МБТ»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•Секвенирование генов МБТ, ответственных за устойчивость к ПТП

•Биочиповая технология

•ДНК-стриповая технология

•Аллель-специфическая ПЦР

Вводная часть (5–10 мин)

Ранняя детекция в мокроте устойчивости МБТ позволяет в интенсивную фазу лечения корректировать режим химиотерапии, что – сокращает сроки абациллирования, – повышает эффективность лечения и предотвращает распространение штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.

В основе действия почти всех антибиотиков лежит связывание их с жизненно необходимыми белками бактериальных клеток и блокирование их функций. Белки кодируются генами. Если в гене бактерий возникнет мутация, структура синтезируемого с него белка изменится. Антибактериальный препарат больше не может связаться с этим измененным белком (или связь с белком слишком слабая) и не блокирует его.

Следовательно, выявление мутаций в генах, отвечающих за синтез белков-мишеней, определит устойчивость бактерий к препаратам.

Основная часть (30 мин)

Разработанные и внедренные в клиническую практику методы детекции мутаций в геноме M.tuberculosis отвечающих за лекарственную устойчивость к ПТП

•Секвенирование (золотой стандарт выявления мутаций): давно разработано, используется в отдельных НИИ, в практику широко не внедрено из-за высокой стоимости анализа

•Биочипы (ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН)

•ПЦР с последующей множественной обратной гибридизацией:

HAIN-тест (Hain lifescience, Германия) на определение мутаций, ответственных за возникновение устойчивости к R,H (GenoType® MTBDRplus), а также этамбутолу, фторхинолонам, инъекционным препаратам (виомицин, канамицин, капреомицин, амикацин)(GenoType® MTBDRsl)

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

• ПЦР в режиме реального времени: Определение мутаций в генах, ответственных за возникновение устойчивости к R, H, с помощью набора "Амплитуб-МЛУ-РВ" фирмы Синтол Биочипы. Значительный прогресс в изучении штаммов с мно-

жественной лекарственной устойчивостью был достигнут при развитии микрочиповой технологии.

В ИМБ им. В. А. Энгельгардта РАН были созданы биологические микрочипы, одновременно выявляющие мутации в геноме МБТ, устойчивых к рифампицину и изониазиду, а также биочипы, выявляющие мутации в генах, ответственных за устойчивость к фторхинолонам. С помощью биочипов можно проводить анализ на ЛЧ как непосредственно из диагностического материала, так и из культуры с плотной и жидкой среды

Этапы теста:

1.Выделение ДНК

2.Проведение ПЦР первой стадии

3.Проведение ПЦР второй стадии. Один из праймеров мечен флюорофором

4.Гибридизация продуктов ПЦР в гибридизационной камере на чипе с олигонуклеотидами в гелевых ячейках

5.Анализ флюоресценции в приборе-анализаторе биочипов.

6.Программная обработка результатов

Время получения результата – 2–3 дня

ПЦР с последующей множественной обратной гибридизацией.

GenoType® MTBDRplus определяет устойчивость к рифампицину и изониазиду. GenoType® MTBDRsl определяет устойчивость к этамбутолу, фторхинолонам, инъекционным препаратам (виомицин, канамицин, капреомицин, амикацин).

Этапы проведения анализа

1.Выделение ДНК

2.ПЦР с праймерами, комплементарными участкам генов, отвечающих за возникновение устойчивости у MБT

3.Гибридизация на стрипах. Продукты ПЦР гибридизуются с нанесенными на стрипы олигонуклеотидами, несущими или не несущими мутацию.

4.Считывание результатов.

Время получения результата – 1–2 дня

ПЦР в режиме реального времени (аллель-специфическая ПЦР).

Определение лекарственной чувствительности и устойчивости с помощью ПЦР в режиме реального времени – определение генных мутаций, ассоциирующихся с устойчивостью к определенным противотуберкулезным препаратам.

Преимущества перед всеми вышеперечисленными методами детекции мутаций в геноме:

1.Значительное снижение времени проведения анализа.

2.Значительное удешевление анализа

3.Значительное снижение риска контаминации

4.Сниженные требования к количеству используемых помещений.

5.Возможность получить информацию о присутствии в образце смешанных популяций микобактерий (чувствительной и устойчивой)

6.Высокая чувствительность метода.

Заключительная часть (5 мин)

В заключительной части лекции преподаватель отвечает на вопросы слушателей

Рекомендуемая литература

1.Антонова О.В., Грядунов С.А., Лапа С.А., Кузьмин А.В., Ларионова Е.Е., Смирнова Т.Г., Носова Е.Ю., Скотникова О.И., Черноусова Л.Н., Мороз А.М., Заседателев А.С., Михайлович В.М. Выявление мутаций в геноме M.tuberculosis приводящих к устойчивости к фторхинолонам методом гибридизации на биологических микрочипах // БЭБИМ. – 2008. – Том 145. – № 1. – С. 115–120.

2.Владимирский М.А., Аляпкина Ю.С., Варламов Д.А., Алексеев Я.И. Применение метода ПЦР в реальном времени для определения и контроля за распространением лекарственно-устойчи- вых штаммов микобактерий туберкулеза // Проблемы туберкулеза и болезни легких. – 2008. – №4. – С. 38–44.

3.Mikhailovich V., Lapa S., Gryadunov D., Sobolev A., Strizhkov B., Chernyh N., Skotnikova O., Irtuganova O., Moroz A., Litvinov V., Vladimirskii M., Perelman M., Chernousova L., Erokhin V., Zasedatelev A., Mirzabekov A. Identification of rfampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by hybridization, PCR, and ligase detection reaction on oligonucleotide microchips // J. Clin. Microbiol.

– 2001. – Vol. 39. – P. 2531–2540.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационная системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Тема 11.4.«Значение ускоренных методов детекции ЛУ для повышения эффективности лечения ТБ»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•Время установления ЛУ МБТ молекулярно-генетическими и традиционными микробиологическими методами

•Эффективность лечения туберкулеза по результатам ускоренного определения лекарственной чувствительности МБТ моле- кулярно-генетическими методами

Вводная часть (5–10 мин)

В задачи противотуберкулезной бактериологической лаборатории входит:

1.Выявление возбудителя.

2.Дифференциация МБТК от НТМБ.

3.Определение лекарственной чувствительности возбудителя.

Основная часть (30 мин)

Время установления ЛУ МБТ молекулярно-генетическими и традиционными микробиологическими методами. Для успешной борьбы с туберкулезом задачей бактериологической службы, в первую очередь, является развитие и внедрение быстрых диагностических тестов на выявление возбудителя и определение лекарственной чувствительности. Время, затрачиваемое на получение результатов анализа на ЛЧ, является важнейшим критерием, по которому следует ориентироваться при выборе метода определения ЛЧ.

Молекулярно-генетические методы определения ЛЧ микобактерий по быстроте получения результатов стоят на первом месте. Однако, полностью отказаться от микробиологических методов определения ЛЧ пока невозможно, так как не для всех препаратов найдены генетические механизмы формирования лекарственной устойчивости. К тому же, высокую сходимость с результатами фенотипической лекарственной чувствительности показали молекулярные тесты на чувствительность к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам. Что касается этамбутола, аминогликозидов и циклических пептидов, молекулярные методы оказались менее точными, совпадения не превышают 50–80%. Очевидно, существуют еще нераскрытые молекулярные механизмы, детерминирующие устойчивость микобактерий к этим препаратам. На слайде представлены методы выявления микобактерий туберкулезного

комплекса и определения ЛЧ, которые к настоящему времени находятся на вооружении бактериологических противотуберкулезных лабораторий. Правильная комбинация методов, а также выбор категорий больных, которым необходимо ставить ЛЧ тем или иным методом, позволит проводить полноценный анализ и минимизировать затраченное время.

Наиболее дешевые и быстрые методы – молекулярно-генети- ческие. Позволяют получить за 1–3 дня с момента поступления больного в стационар точные данные о наличии у него туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, т.к. наблюдается высокая сходимость результатов между фенотипической и генотипической устойчивостью для рифампицина и изониазида. Выявление мутаций в генах гиразы будет косвенно свидетельствовать о ШЛУ-туберкулезе. Следовательно, определять мутации в геноме микобактерий, отвечающих за возникновение ЛУ, необходимо всем категориям больных при поступлении в стационар и для последующего контроля химиотерапии (отслеживать нарастание лекарственной устойчивости).

После получения результатов молекулярно-генетического определения ЛЧ, по крайней мере, к трем препаратам (R,H,Fq) врач может скорректировать схему противотуберкулезной химиотерапии для поступившего в стационар больного.

Определение ЛЧ в системе BACTEC MGIT 960 занимает в среднем 1 месяц (от момента посева образца и до получения результата ЛЧ). Достоинства по сравнению с молекулярно-генети- ческим методами – можно получить результаты по большому спектру ПТП 1-го и второго ряда. Поэтому результат ЛЧ, полученный на BACTEC MGIT 960, может помочь врачу (дополнительно к уже полученным результатам молекулярно-генетических методов) уточнить чувствительность МБТ к другим препаратам и, если нужно, составить индивидуализированную схему лечения (для ШЛУ туберкулеза). Поэтому определение ЛЧ в системе BACTEC MGIT 960 также необходимо проводить для всех категорий пациентов, впервые поступивших в стационар на лечение.

К сожалению, определение ЛЧ в системе BACTEC MGIT 960 очень дорого. Например, стоимость одного анализа на чувствительность к S, I, R, E доходит до 2500 р. Поэтому для больных с хроническим туберкулезом, для которых уже известны результаты ЛЧ, можно проводить контроль химиотерапии с использованием метода абсолютных концентраций на плотных средах. Этот метод наиболее длителен (до 2-х, а то и 3-х месяцев после получения ди-

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы