6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Флуоресцентные_методы_диагностики_в_медицине_Колтовой_Н_А_Краевой
.pdf
резонансный перенос энергии с триптофанилов на продукты, образующиеся при реакции апобелков с продуктами перекисного окисления липидов.
Собственная флуоресценция белков обусловлена наличием трех ароматических аминокислот (трех аминокислотных остатков) (всего имеется 20 аминокислот в составе живых организмов) - фенилаланин, тирозин и триптофан, которые имеют следующие максимы флуоресценции (258, 282), (276, 303), (280, 348). В меньшей степени обладают флуоресценцией гистидин (290, 425) и пролин. Наибольший вклад во флуоресценцию белков (90%) вносит аминокислота - триптофан.
Спектр поглощения триптофана имеет три пика: на длине волны 197 нм (коэффициент экстинкции 20500), пик 218 нм (коэффициент экстинкции 33000) и пик 280 нм (коэффициент экстинкции 5600). Пик 280 нм определяется поглощением индольного кольца. Пик 280 нм имеет слабо выраженную колебательную структуру - два маленьких пика 272 и 288 нм.
1988 - Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. Киев. Наукова Думка.
1988. 277 с.
Два основных пика поглощения 218 и 280 нм определяются двумя типами переходов электронов в индольном кольце пи-пи и эн-пи переходами.
Таблица 1-2. Коэффициенты экстинкции для триптофана.
Длина волны, нм |
197 |
218 |
280 |
390 |
300 |
310 |
Коэф. экстинкции |
20500 |
33000 |
5600 |
4500 |
500 |
20 |
В длинноволновой области - крутой спад.
Перекрытие спектров поглощения и излучения для триптофана находится в диапазоне от
300 до 310 нм.
Флуоресценция ароматических аминокислот определяется наличием делокализованных пи-электронов в ароматическом кольце.
При поглощении фотонов возбуждения, энергия в молекуле белка перераспределяется, и излучают энергию (флуоресцирует) в основном триптофановый остаток. Это связано с тем, что спектр флуоресценции тирозина перекрывается со спектром возбуждения триптофана. При возбуждении тирозина осуществляется безизлучательный перенос энергии от тирозина к триптофану с помощью индуктивно-резонансного механизма.
Рис. 1-9. Перекрывание спектра флуоресценции тирозина (1) и спектра возбуждения триптофана (2).
1965 - Владимиров, Ю.А. Фотохимия и люминесценция белков, 1965, Москва: Наука. 232 стр. 1988 - Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. Киев. Наукова Думка.
1988. 277 с.
2003 - Пермяков Е.А. Метод собственной люминесценции белка. Москва. Наука. 2003. 180с.
11
Определение гамма-глобулинов методом флуоресценции.
1982 - Нечеса Г.Я. (Москва, НИИ пушного звероводства) Способ определения гаммаглобулинов сыворотки крови. Патент 953562. 1982.+
В белках тирозин и триптофан ходят в состав альбуминов и глобулинов. Поэтому, измеряя интенсивность флуоресценции, можно определить только общее количество белков. Для определения концентрации гамма глобулинов применяется следующая методика. Флуоресценцию триптофана определяют в 14% растворе йодистого калия, при длине волны возбуждения 286-306 нм, и длине волны регистрации 340-370 нм. При выбранных условиях флуоресцируют в основном остатки триптофана, которых много у гамма-глобулинов, и нет у альбуминов. Поэтому альбумин и другие белковые фракции не влияют на интенсивность флуоресценции.
1990 - Добрецов Г.Е. Айдыралиев Р.К. (Москва, НИИФХМ МЗ РСФСР) Способ определения альбумин-глобулинового коэффициента крови. Сравнивают интенсивность флуоресценции сыворотки крови до и после добавления флуоресцентного красителя N-фенил-1-амино-8- сульфонафталин (АНС), и рассчитывают значение альбумин-глобулинового коэффициента.
Взаимодействие света с белками. Безизлучательный перенос энергии.
Различные переходы между уровнями обычно представляют в виде диаграммы Яблонского.
Рис. 1-10. Диаграмма Яблонского переходов электронов между различными уровнями.
12
Рис. 1-11. Связь между переходами с различных уровней и пиками в спектрах поглощения и флуоресценции.
При поглощении фотона белок переходит в возбужденное состояние: БН + hv1 -> БН*. Затем либо энергия возбуждения передается в тепловую энергию, либо испускается фотон люминесценции: БН* -> БН + hv2 где v2<v1.
Если фотон имеет большую энергию, то происходит фотоионизация - электрон отрывается от молекулы белка и захватывается молекулами воды, сольватируется:
БН -> БН+ + е-. В результате образовался ион-радикал белка.
Ион-радикал является неустойчивым, и распадается на свободный радикал и протон водорода: БН+ -> Б* + Н+.
Затем может образоваться перекисный радикал: Б* + О2 -> БОО*
Для селективного возбуждения остатков триптофана в различных белках используют длины волн от 295 до 305 нм. В этом диапазоне поглощение тирозина и фенилаланина минимально.
Флуоресценцию тирозина можно наблюдать в белках, не содержащих остатков триптофана. Тирозин имеет максимум спектра флуоресценции при 303 нм, а его интенсивность на порядок ниже, чем у триптофана. На положении максимума флуоресценции тирозина, в отличие от триптофана, не сказываются конформационные перестройки макромолекулы. Тирозин интенсивно флуоресцирует в растворе и при денатурации белков, сохраняя положение максимума. Включение тирозина в состав белка сопровождается лишь эффектом тушения флуоресценции и падением квантового выхода. Перекрытие спектров поглощения и излучения для тирозина находится в диапазоне от 270 до 290 нм.
Флуоресценцию фенилаланина можно наблюдать только у тех белков, которые не содержат триптофана и тирозина. Спектр флуоресценции фенилаланина имеет максимум при 282 нм, и его квантовый выход еще на порядок ниже, чем у тирозина. Перекрытие спектров поглощения и излучения для фенилаланина находится в диапазоне от 260 до 280 нм.
Максимум флуоресценции сложных молекул сдвинут в коротковолновую область по сравнению с максимум флуоресценции отдельных компонент молекулы. Еще в 1925 году было показано, что спектр поглощения белков сыворотки крови отличается от спектров поглощения аминокислот. Спектр поглощения аминокислот сдвинут в длинноволновую область. Максимума флуоресценции триптофана в белках по отношению к свободному триптофану сдвинут в коротковолновую область.
13
Обнаружено, что положение максимума триптофановой флуоресценции различно у разных белков. Различное положение максимуму флуоресценции триптофана в различных белках связано с тем, что на флуоресценцию триптофана сильно влияет окружение. Кроме того, в различных молекулах белка имеется различное количество остатков триптофана, которые расположены в различных областях молекулы белка. Сдвиг максимума в коротковолновую область характерен для малополярного окружения. Сдвиг в длинноволновую область характерен для полярного окружения. В качестве примера, можно привести положение максимумов триптофановой флуоресценции ряда белков в водных растворах при возбуждении светом с длиной волны 280 нм:
-инсулин (304 нм), -рибонуклеаза (304 нм) - один триптофановый остаток, -яичный альбумин (328 нм),
-бычий сывороточный альбумин (330 нм) - два триптофановых остатка, -химотрипсиноген (330 нм), -трипсин (332 нм), -трипсиноген (332 нм), -фибриноген (337 нм)
-сывороточный альбумин человека (339 нм) - один триптофановый остаток, -лизоцим (341 нм), -пепсин (342 нм), -триптофан в воде (347 нм)
Белки, содержащие единственный остаток триптофана: -азурин (308 нм), -рибонуклеаза Т1 (324 нм),
-сывороточный альбумин человека (342 нм), -нуклеаза (334 нм), -менеллин (342 нм), -глюкагон (352 нм).
- Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. Киев. Наукова Думка. 1988. 277с.
В составе белка триптофан может находиться в различных состояниях: 1-флуоресценция 308 нм 2-флуоресценция 316 нм
3-остаток триптофана находится во внутренней, гидрофобной неполярной области белка. В этом случае максимум флуоресценции триптофана находится в диапазоне 330-332 нм. 4-промежуточная форма, остаток триптофана находится на поверхности белка в гидрофильном окружении. В этом случае максимум флуоресценции триптофана находится в диапазоне 340342 нм.
5-остаток триптофана находится на денатурированном белке, в свободном контакте с молекулами воды. В этом случае максимум флуоресценции триптофана находится в диапазоне
350-353 нм.
У аминокислот поглощают и излучают системы сопряженных связей - ароматические кольца.
14
1.2.2 Альбумин.
Молекула сывороточного альбумина человека состоит из одной аминокислотной цепи, содержащей 585 аминокислотных остатков, масса - 66,4 кДа. Белок имеет глобулярную структуру. Третичная структура альбумина состоит из трех практически одинаковых доменов. Центральная область каждого домена образована гидрофобными остатками, а внешняя часть каждого домена состоит из гидрофильных остатков. При физиологическом значении рН только 60% аминокислотных остатков уложена в альфа-спирали. Остальные аминокислотные остатки имеют хаотическую укладку. Доля бета складчатых структур составляет 2%.
Молекула альбумина человека содержит один остаток триптофана Trp 214 и 17 остатков тирозина. Бычий сывороточный альбумин содержит два остатка триптофана - Trp 135 и Trp 214.
Рис. 1-12. Расположение остатка триптофана в молекуле человеческого сывороточного альбумина
Рис. 1-13. Двумерный спектр альбумина и сечение на длине волны 280 нм. На приведенном спектре видно, что максимум флуоресценции альбумина имеет вытянутую форму от 300 до 360 нм.
15
Рис. 1-14. Спектр флуоресценции альбумина при возбуждении различными длинами волн.
Свечение тирозина проявляется в виде небольшого подъема в коротковолновой части спектра альбумина. Повышенное значение флуоресценции альбумина в области 400-550нм можно объяснить вкладом триптофановой фосфоресценция. На положение максимума флуоресценции альбумина и форму пика влияют различные компоненты:
1-303 нм - флуоресценция тирозина 2-322-330 нм - альбумин + лиганд
3-348 нм - триптофан в составе альбумина - положение основного максимума 4-350-353 нм - триптофан в денатурированном альбумине 5-354 нм - флуоресценция молекулы триптофана, 6-400-450 нм - фосфоресценция триптофана.
Альбумин имеет два максимума флуоресценции пик 1-(274, 348) и пик 2-(231, 350).
Пик 1 соответствует флуоресценции триптофанфана и тирозина (303 нм - Tyr - тирозин, 348 нм - Try - триптофан),
Пик 2 отражает вторичную структуру альбумина и определяется окружением молекулы альбумина.
Таблица 1-3. Длины волн возбуждения и флуоресценции для пика 1 и пика 2 флуоресценции альбумина, полученные различными авторами.
Пик а - пик Рэлевского рассеивания (длина волны излучения равна длине волны возбуждения). Пик в - пик Рэлеевского рассеивания второго порядка. Длина волны излучения равна удвоенной длине волны возбуждения.
Пик 1 |
Пик 2 |
Пик а |
Пик в |
(274,348) |
(231,350) |
(250,250) |
(250,500) |
(280,348) |
(231,350) |
|
|
(280,344) |
(230,338) |
|
|
(280,345) |
(225,343) |
|
|
(275,339) |
(225,352) |
|
|
(284,336) |
|
(320,320) |
|
(285,340) |
(220,340) |
(210,210) |
|
16
Рис. 1-15. Двумерный спектр флуоресценции альбумина, пик 1-(274,348), пик 2-(231,350).
Рис. 1-16. Двумерный спектр флуоресценции альбумина человека (HSA - Human Serum Albumin). Пик 1-(280,344), пик 2- (230,338).
17
Рис. 1-17. Двумерный спектр флуоресценции альбумина человека (HSA - Human Serum Albumin). Пик 1-(284,336), пик а- (320,320).
Рис. 1-18. Двумерный спектр флуоресценции альбумина человека (HSA - Human Serum Albumin). Пик 1- (280,345), пик 2- (225,343).
18
Рис. 1-19. Двумерный спектр флуоресценции триптофана в обычных (A) и в относительных (B) координатах.
Рис. 1-20. Двумерный спектр флуоресценции аналога триптофана (280,340).
19
Рис. 1-21. Двумерный спектр флуоресценции триптофана и тирозина.
Расчетные параметры при анализе спектра флуоресценции альбумина.
1-Интенсивность флуоресценции и положение максимума при возбуждении УФ излучением с длиной волны 275 нм, 2-Ширина пика флуоресценции на высоте, равной 3/4 значению от максимального,
3-Ширина пика флуоресценции на высоте, равной 1/4 значению от максимального, 4-Величина левого и правого плеча. Вычисляются длины волн слева и справа от максимума, при которых величина флуоресценции составляет половину максимального значения - L-лев, L-
прав. Величина левого плеча определяется как (L-max - L-лев). Величина правого плеча определяется как (L-прав - L-max).
5-Отношение коротковолновой и длинноволновой флуоресценции: (275,348)/(275,450), 6-Отношения высот двух пиков альбумина - (274,348)/(231,350).
Агрегация молекул альбумина.
В сыворотке крови молекулы альбумина существуют в виде мономеров и в виде олигомерных форм (дву-, три- и тетрамерных) форм.
1.2.3 Флуоресценция соединений альбумина с различными веществами (легандами).
Альбумин + лиганды.
Соединение альбумина с различными лигандами вызывает конформационную перестройку альбумина, и изменение третичной структуры. При этом изменяется спектр флуоресценции. Максимум флуоресценции смещается в коротковолновую область до 322330 нм, интенсивность флуоресценции снижается на 30-50 %. Интересно, что внесение тех же компонент не в альбумин а в триптофан не вызывает изменений флуоресценции.
Спектр флуоресценции белков изменяется при изменении окружения белка, при изменении структуры белка, при связывании белков с лигандами, при образовании ассоциатов белок-белок, при агрегации белковых молекул, при денатурации белков (степень денатурации), степень изменения гидратной оболочки, степень агрегации.
Причины изменения структуры белков:
20