2 курс / Нормальная физиология / Гемостаз_Физиологические_механизмы,_принципы_диагностики_основных

Указанные статистические параметры могут быть рассчитаны при наличии в лаборатории контрольного материала - плазмы с заранее известными значениями того или иного показателя свертывающей системы. Контроль качества по контрольным материалам является наиболее простым и надежным способом обеспечения качества выполняемых исследований. При использовании контрольных материалов контролируются все звенья технологической цепочки - лабораторная посуда, реактивы, погрешность дозирования, измерения и т.д.

Современные калибровочные и контрольные материалы, используемые

вкоагулологии, готовятся высокотехнологическими промышленными методами на основе человеческой цитратной плазмы, полученной из крови большого количества доноров. Такой подход к приготовлению материала позволяет нивелировать индивидуальные особенности системы гемостаза и считать их референтными контрольными материалами. Выпускаются контрольные и калибровочные плазмы в лиофилизированной форме, имеют большой срок хранения и обрабатываются после растворения как обычные пробы. Могут применяться как для автоматических, так и для мануальных методов. Несмотря на тщательный контроль за донорами, кровь которых использована, работать с контрольными материалами необходимо с теми же предосторожностями от заражения СПИДом и гепатитом, как и при любой биологической пробе, т.к. ни один метод лабораторного контроля инфицированности не дает в настоящее время 100% гарантии.

Калибровочные растворы и контрольные плазмы не являются синонимами и используются для различных целей. Калибровочные растворы используются для построения калибровочных графиков при мануальных исследованиях и для калибровки аппаратов при автоматических методах. В последнем случае паспортные данные калибраторов вводятся в коагулометр

врежиме калибровки, что обеспечивает высокую точность последующих измерений, а также возможность устранять существующую погрешность, если калибровочный коэффициент выходит за допустимые пределы отклонений. Существуют калибровочные плазмы для определения активности протромбинового комплекса по Quick, фибриногена, факторов свертывания, калибровочная плазма для колориметрических методов (AT III, протеин С), калибровочная плазма для определения концентрации нефракционированного и низкомолекулярного гепарина и др. Референтное значение показателя устанавливается для каждого лота калибровочной плазмы.

Аттестованные коммерческие контрольные материалы (контрольная плазма), применяемые в коагулологии, могут быть двух видов – нормальная и патологическая. Перечень показателей, которые могут быть оценены по контрольной референтной плазме, отличается в зависимости от технологии ее производства, характера тестирования, лота. Наиболее распространенные показатели референтных величин для нормальной плазмы: ПВ, АПТВ, ТВ, фибриноген, факторы свертывания, антитромбин III, протеины С и S,

плазминоген, а2-антиплазмин. Патологические контрольные плазмы характеризуются разными уровнями активности факторов свертывания и, следовательно, разными коагулологическими показателями. Кроме вышеперечисленных контрольных материалов используются и специальная контрольная плазма для мониторинга антикоагулянтной терапии (исследуются ПВ или АПТВ). Требуемая точность для такого рода контрольного материала - до ± 3-5%. Аттестованные контрольные материалы наиболее дорогие. За рубежом аттестация проводится в референтных лабораториях, по результатам исследований материал получает паспорт с указанием значений исследуемых параметров, перечнем методов и наборов реактивов. Многие фирмы-изготовители предупреждают о необходимости использования реагентов той же фирмы. Это объясняется тем, что в отличие от свежих проб пациентов, коммерческие контрольные материалы содержат различные искусственные добавки (стабилизаторы, активаторы, консерванты), которые могут влиять на результат исследования.

Помимо нормальной и патологической контрольной плазмы в целом ряде случаев в коагулологии используется неаттестованный контрольный материал. Для таких материалов известен лишь их грубый диапазон (норма, патология). Примером могут служить сливные плазмы или сыворотки, которые могут готовиться в самой лаборатории и использоваться для контроля воспроизводимости. Положительным моментом в использовании сливного материала является то, что он абсолютно идентичен пробам пациента, имеет очень низкую стоимость, прозрачен, не имеет ошибки разведения. Однако сливные плазмы не могут быть использованы для контроля на правильность, имеют ограниченную стабильность и высокую опасность инфицирования. Трудно иметь сразу большую партию сливной плазмы.

Проведение внутрилабораторного контроля качества

Система внутрилабораторного контроля качества позволяет эффективно выявлять ошибки, связанные с такими варьирующими факторами, как реагенты, в том числе организация в лаборатории «домашних реактивов», калибраторы, расходные материалы, обучение персонала, обслуживание приборов, ведение документации, реакция персонала на возникающие проблемы. Считается, что такие факторы как правильность калибровки, выбранный аналитический принцип, качество закупаемых реагентов и приборов, соблюдение времени и температуры реакции, точность пипетирования реагентов и проб, частота проведения калибровок эффективнее контролируются извне.

Принцип проведения внутреннего контроля состоит в следующем: с выбранной периодичностью проводят исследования одного и того же контрольного материала по оцениваемой методике, а результаты этих измерений заносят на контрольную карту. Наиболее распространенным является использование контрольной карты Shewhart. Принцип построения

контрольной карты, предложенной в 50-ые годы, основан на теории вероятности, и предполагает, что при последовательном проведении исследований на одном и том же материале

1.примерно 5% результатов (или каждый 20-ый результат) может быть за пределами горизонтальных линий, отсекающих ±2 стандартных девиации,

2.результаты должны достаточно равномерно распределяться по обе стороны от линии среднего значения и примерно 2/3 результатов должны лежать в пределах ±1 стандартная девиация,

3.результаты за пределами ±3 стандартных девиаций должны быть редкими и не превышать 0,25% от общего количества результатов (не чаще, чем каждый 333-ый результат).

Для построения контрольной карты Shewhart необходимо много-

кратное (чаще всего на протяжении 20 дней в серии ежедневных исследований по данной методике) исследование контрольного материала. Из результатов рассчитывают среднюю арифметическую (Хср) и стандартное отклонение (a, SD), на основании которых вычисляют контрольные пределы

истроят карту контроля качества, где проводят несколько горизонтальных линий соответственно вычисленному среднему, двум и трем стандартным отклонениям. При каждом последующем исследовании данного контрольного материала наносят его значение на контрольную карту, имея в виду, что по оси абсцисс откладываются дни исследования, а по оси ординат - результат исследования (рис.16). Для каждого уровня контрольного материала (норма/патология) и для каждого теста строится своя контрольная карта.

Рис.16. Контрольная карта Shewhartdnn фибриногена (гравиметрический метод), построенная на основании Хср = 3,09 г/л, п=40,а = 0,30 г/л, CV = 9,7% и заполненная далее в течение 8 дней.

Удобно вести для каждого теста две контрольные карты на одной странице для двух уровней контрольного материала (норма/патология). При нанесении двух дополнительных линий, ограничивающие предел ±1 о от средней величины, мы получаем модификацию карты, которая называется контрольной картой Westgard.

При использовании аттестованного коммерческого контрольного материала для построения контрольной карты можно сразу, не дожидаясь накопления серии до n > 20, оценивать результаты. В этом случае, так называемое, должное значение для используемой модификации метода, указанное в инструкции к контрольному материалу, следует принять за

среднюю арифметическую (Хср), доверительный предел - за предел Хср ± 1 о и самостоятельно рассчитать два других предела (Хср ± 2 а и Хср ± 3 о), необходимых для построения контрольной карты. Важно помнить, что модификация используемого метода должна соответствовать паспортным данным контрольного материала и что наилучшего результата можно достичь, используя реагенты и контрольную плазму или сыворотку одной и той же фирмы.

После набора собственных данных из 20-30 значений необходимо рассчитать на их основе собственное среднее значение и сравнить его с аттестованным (паспортным). Среднее значение не должно отклоняться от аттестованного более чем на половину допустимого значения σ.

К сожалению, часто (особенно в коалулологии) лаборатории не имеют постоянного коммерческого аттестованного материала или пользуются модификацией метода, неописанного в инструкции к имеющемуся контрольному материалу. В таком случае могут быть использованы сливные контрольные плазмы или неисследованный коммерческий контрольный материал для построения контрольной карты Shewhart. Для анализа сливного или неисследованного контрольного материала рекомендуется для каждого метода и каждого уровня контрольного материала (норма/патология) предприйять следующие действия:

-разлить материал по аликвотам и заморозить при -20°С или ниже;

-провести единую серию измерений (n = 20-30), включая исследования

вежедневную серию измерений;

-по полученным результатам рассчитать среднее арифметическое значение (Хср) , стандартное отклонение (а) и коэффициент вариации (CV, %),

-сильно отклоняющиеся от среднего значения результаты (выбросы) могут сдвинуть среднее значение и увеличить стандартное отклонение. Поэтому, если после проведения расчета выясняется, что какой-либо результат отклоняется от Хср более чем на 3 а, он должен быть исключен из расчета. После этого Хср, а и CV должны быть пересчитаны заново. Однако таких результатов должно быть не более одного.

-рассчитанный CV надо сравнить с допустимым для данного параметра. Если рассчитанный CV больше, то необходимо исследовать причины плохой воспроизводимости и устранить их.

Полученные окончательно величины могут служить основанием для построения контрольной карты по данному конкретному контрольному материалу: Хср ± 2а и Хср ± 3а. Далее можно работать с данным контрольным материалом и данной модификацией метода, следуя всем правилам оценки результатов измерения контрольных проб.

Описанным способом можно приготовить сливные бестромбоцитарные плазмы для коагулологических исследований.

Оценка контрольных карт. Построение контрольной карты выявляет погрешности в воспроизводимости и правильности исследования. Если воспроизводимость и правильность проводимых измерений стабильны и

удовлетворительны, то все следующие результаты измерения контрольного материала должны подчиняться некоторым правилам, которые являются следствиями закона нормального распределения. Получаемые результаты должны приблизительно поровну располагаться по обе стороны от среднего значения, не должны непрерывно возрастать или убывать и не должны сильно отклоняться от среднего значения.

Распространенным принципом оценки контрольных карт являются правила Westgard, которые используются для оценки типа ошибки - случайная или систематическая (табл.13).

Следует помнить, что правила, выявляющие систематическую ошибку, реагируют на случайную ошибку, и наоборот.

Таблица 13 Правила Westgard для оценки результатов внутреннего контроля качества с использованием контрольных карт (печатается по Долгову В.В. с соавт.)

Критерий I2SD - сигнал для применения других критериев! В приведенной нами контрольной карте (рис.16) активен критерий 13so - необходимо искать случайную или систематическую ошибку.

Другой способ оценки контрольных карт - применение критериев

Buttner.

1. Предупредительные критерии:

6 результатов подряд находятся по одну сторону от линии среднего арифметического значения

3 результата подряд находятся вне пределов Хср ± 1 а 1 результат находится вне пределов Хср ± 2 а

2. Контрольные критерии:

8 результатов подряд отклоняются по одну сторону от среднего арифметического значения

4-5 результатов подряд находятся вне пределов Хср ± 1 а 3 результата

находится за пределами Хср ±2 a 1 результат находится за пределами Хср ± 3 а При появлении результатов, соответствующих предупредительным критериям ответ анализа можно выдать на отделение, но необходимо тщательно проанализировать все этапы работы: калибровочные растворы, работу измерительных приборов, расчеты и т.д. При появлении результатов, соответствующих контрольным критериям, анализы задерживаются и принимаются меры для выявления и исключения ошибок.

Карты Shewhart - не единственный, но наиболее часто используемый наглядный вариант оценки работы лаборатории по проведению внутрилабораторного контроля качества. *

Кроме представленных выше способов проведения внутреннего контроля качества существуют другие варианты оценки исследований без использования контрольного материала. Однако они имеют право на жизнь только как дополнительные и проводятся в лабораториях, где один и тот же параметр исследуется в большой серии (например, определение протромбинового времени в условиях крупной поликлиники или стационара с однородным контингентом обследуемых). Необходимо помнить, что по современным представлениям адекватной системой оценки может быть только система, использующая контрольные материалы.

Карта по ежедневным средним (контроль правильности). Для некоторых коагулологических исследований в качестве дополнительного можно рекомендовать контроль по ежедневным средним, в котором используются результаты исследования образцов пациентов. Преимуществами этого метода является то, что он, с одной стороны, не требует специального контрольного материала, с другой стороны, позволяет выявлять ошибки не только на аналитическом этапе, но и некоторые ошибки, возникающие на преаналитическом этапе (например, связанные с взятием или предварительной обработкой проб пациентов).

Однако прежде, чем приступить к ведению карт по ежедневным средним, нужно учесть следующее:

Обследуемый изо дня в день контингент должен быть достаточно однородным (т.е. не должно быть сильных количественных и качественных изменений обследуемых лиц).

1. Если в лаборатории в определенные дни происходит смена обследуемого контингента, то средние значения по этим дням в расчет принимать не следует.

3.Если усреднять все полученные значения, то даже один сильно патологический результат может существенно изменить среднее значение. Поэтому в расчет должны приниматься только те значения, которые укладываются в определенные пределы (диапазон усреднения).

4.Пределы усреднения могут быть установлены достаточно произвольно. Как правило, рекомендуется использовать нормальный диапазон или брать шире его в 1,2 - 2,0 раза.

5.Диапазон усреднения не должен быть слишком узким, так как это снижает чувствительность данного метода контроля к выявлению ошибок, но

и не должен быть слишком широким, так как при этом будет большой разброс средних изо дня в день.

6.Минимальное количество усредняемых ежедневно результатов должно быть не менее 15, лучше 50 - 70, это зависит от теста и от нагрузки в лаборатории.

7.Большая часть пациентов должна иметь результаты в области усреднения. Не имеет смысл вести контроль качества по ежедневным средним, если результаты данного теста значительно отклоняются от средней величины.

8.Необходимо обрабатывать достаточно большие массивы данных. Ручной расчет очень трудоемок, желательно проводить автоматизированный контроль.

Карты по ежедневным средним анализируются по тем же правилам, что и карты по контрольным материалам. Для построения карт по ежедневным средним (карты аналогичные картам Shewhart ) необходимо выполнить следующие действия:

1.В течение 20 дней ежедневно рассчитывать среднее по результатам пациентов, попавших в диапазон усреднения;

2.По этим значениям рассчитать среднюю, дисперсию и коэффициент вариации;

3.Если рассчитанный коэффициент вариации (CV) существенно больше, чем CV, получаемый изо дня в день по контрольным материалам, значит количество усредняемых в день результатов пациентов недостаточно

итребуется увеличение количества усредняемых результатов, иначе ведение карты по ежедневным средним теряет смысл.

Карта по дубликатам (контроль воспроизводимости) может при-

меняться в лабораториях, где какой-либо компонент исследуется в большой серии (более 30 проб). В таком случае рекомендуется включать исследование проб одного и того же пациента, как с нормальными, так и с патологическими уровнями содержания исследуемого компонента, в каждую серию и через 20-30 проб в длинной серии. Рассмотрим вариант построения такой карты для оценки ПВ в лаборатории, которая ежедневно обрабатывает 40-60 проб. Для построения карты по дубликатам необходимо выполнить действия в два этапа:

1.Измерить ежедневно дважды ПВ в пробе одного пациента с интервалом не более 20 мин.(чтобы избежать изменения активности протромбинового комплекса во времени). Такие ежедневные исследования пробы в дубликатах необходимо провести не менее 10-20 раз. По полученным результатам вычисляется стандартное отклонение (б) и коэффициент вариации (CV). Рассчитанный CV сравнивается с допустимым CV для данного параметра. Если рассчитанный CV больше, то необходимо исследовать причину плохой воспроизводимости и устранить ее.

2.За каждый день рассчитать разность между полученными в этот день результатами измерения дубликатов контрольного материала (разность берется по модулю, т.е. без знака). По полученным ежедневным разностям

нужно рассчитать среднюю,, разность между дубликатами за период наблюдения, а на ее основании - предупредительную и контрольную границы с использованием коэффициентов: при проведении ежедневно двух исследований в серии предупредительной границей будет средняя разность, умноженная на 2,45, а контрольной границей - на 3,22. Предупредительная и контрольная границы параллельны оси X. Ось X соответствует нулевой разнице. Так, если средняя разность в дубликатах 20 пар исследований ПВ составила 0,8 сек., то предупредительная границы будет соответствовать 1,96 сек., а контрольная граница -2,58 сек. Ежедневные значения разницы между дубликатами (также по модулю) наносятся на эту карту (рис.17). Чем меньше различия в дубликатах (парах исследований), тем уже контрольные и предупредительные границы и «жестче» требования к последующим измерениям.

Рис. 17. Карта по дубликатам для ПВ, определенного на коагулометре.

Правила интерпретации карты по дубликатам: «Строгие» правила:

- Ни одна из разностей не должна выходить за контрольную границу. - Две разности подряд не должны выходить за предупредительную границу

Предупредительные правила:

Две разности из последовательных 20 не должна выходить за предупредительную границу.

Три-четыре разности подряд не должны лежать вблизи предупредительной границы.

Карты по дубликатам позволяют обнаружить изменение воспроизводимости в течение дня. Желательно одновременное ведение карты Shewhart «по средним» для контроля правильности и воспроизводимости.

Приведенные выше способы могут быть использованы в лаборатории коагулологии при проведении ручных методов исследования или использовании наиболее простых моделей коагулометров, являющихся приборами, которые лишь фиксируют время образования фибринового сгустка. Автоматические и полуавтоматические анализаторы имеют индивидуальные встроенные программы контроля качества и проведение исследования без обеспечения действия этих программ невозможно. Трудности внутрилабораторного контроля качества коагулологических исследований состоят в том, что в условиях отсутствия аттестованного

контрольного материала сложно проводить другие виды контроля из-за нестабильности во времени компонентов свертывающей системы в сливной плазме, осутствия во многих лабораториях достаточного количества проб (за исключением повсеместно исследуемого ПВ), особенно с патологическими значениями. Не уточнены данные о коэффициенте вариации для многих методик, оценка компонентов свертывающей системы остается качественной или косвенной.

Наиболее четко поддающимися внутрилабораторному контролю параметрами являются показатели, основанные на определении времени образования фибринового сгустка: ПВ, АПТВ, тромбиновое время, фибриноген по методу Клаусса, а так же - число тромбоцитов. Эти исследования составляют основу и действующих в настоящее время систем внешней оценки качества как у нас в стране, так и за рубежом.

Внешний контроль качества

Внешний контроль качества - это система объективной оценки результатов исследований в лаборатории, осуществленная внешней организацией с целью обеспечения сравнимости результатов, получаемых в разных лабораториях (6).

В отличие от внутреннего контроля, который организует и проводит ежедневно сама лабораториям который выявляет в основном случайную ошибку, внешний контроль проводится периодически сторонней организацией и направлен на выявление ошибки систематической.

Принципиально система внешнего контроля может быть построена по двум принципам: либо искомое значение («цель») устанавливается референтным методом в референтной лаборатории, либо искомое значение рассчитывается на основании статистической обработки результатов, полученных от участвующих в исследовании лабораторий.

Федеральная система внешней оценки качества (ФСВОК), работая по последнему принципу, включает в оценку количественное определение фибриногена, протромбинового времени и активированного частичного тромбопластинового времени. В качестве контрольных образцов используются лиофилизированные образцы плазмы крови человека с нормальным и патологическим уровнями измеряемых показателей производства НИИ гематологии и переливания крови (г.Вятка) и ТОО "Технология" (г.Барнаул). Проводится три цикла ежегодно. Результаты измерений, информация об использованных методах анализа, значения протромбинового времени и АПТВ в нормальной плазме, используемое в лаборатории для расчета значений их индексов, вписываются в соответствующие формы. С целью представления результатов лабораторий в соизмеримых единицах значения протромбинового времени и АПТВ пересчитываются в соответствующие индексы. Ниже приведены примеры представления результатов оценки качества исследования ПВ и АПТВ в лаборатории Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им.акад.И.П.Павлова.

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СИСТЕМА ВНЕШНЕЙ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ КОАГУЛОЛОГИЯ

Цикл 3-98 Лаборатория: 00057 С-Петербургский мед.университет им.Павлова,

центральная КДЛ

Определяемый показатель: ИНДЕКС АПТВ ОЦЕНКА ПРАВИЛЬНОСТИ (гистограммы средних значений):

ОЦЕНКА ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ (гистограммы относительного размаха):

РЕЗУЛЬТАТЫ ВНЕШНЕЙ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА