2 курс / Нормальная физиология / Молекулярные_и_физиологические_механизмы_старения_в_2_т_,_Т_2_Анисимов

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

Кроме того, у этих мышей было выявлено снижение экспрессии генов, вовлеченных в систему, обеспечивающую постнатальный рост животных, включая ген рецептора гормона роста. Авторы склонны рассматривать указанные проявления у мутантных мышей с синдромом прогерии как компенсаторный, адаптивный механизм, включающийся в ответ на накопление повреждений в ДНК.

Ku-86 — белок, играющий существенную роль в репарации двухцепо- чечных разрывов ДНК негомологичным белком Ku70. Мутантные мыши (ku86–/–) по сравнению с диким типом быстрее стареют, что проявляется остеопенией, атрофией кожи и волосяных фолликулов, дегенерацией гепатоцитов, развитием гиперпластических узелков в печени и повышенной смертностью (Vogel et al., 1999). Повышенная частота развития рака и, возможно, сепсиса (связанного с реактивным иммунным ответом), по-видимому, основная причина повышенной смертности у этих мышей. Следует отметить, что повышение смертности у мышей ku86–/– начинается вскоре после полового созревания, приводя к снижению плодовитости. In vitro мышиные клетки с дефицитом Ku80 имеют заметно увеличенную частоту хромосомных аберраций, включая разрывы, транслокации и анеуплоидию (Difilippantonio et al., 2000).

Частота возникновения рака у мышей ku–/– в 13 раз ниже, чем в контроле, однако у мутантных мышей опухоли развиваются раньше (Vogel et al., 1999). В то же время у нокаутных мышей ku70–/–, имеющих тот же генети- ческий фон (129Sv C57BL/5) и также укороченную продолжительность жизни, имеет место высокая частота CD4+—ÑD8+ Т-клеточных лимфом, развивающихся в среднем в возрасте 6 месяцев (Li et al., 1998). Эти наблюдения позволяют предполагать, что один или оба этих белка функционируют независимо. Известно, что белок р53 контролирует хромосомные повреждения и останавливает клеточный цикл, либо запускает апоптоз в клетках с нерепарированными повреждениями. Для изучения вопроса о включении р53 в прекращение роста у Ku80–/– мышей были выведены мыши с двойной мутацией Ku80–/–ð53–/– (Difilippantonio et al., 2000). Хотя мыши развивались нормально, все они умерли до 12-недельного возраста от диссеминированной В-клеточной лимфомы. Напротив, у нокаутных мышей ð53–/– развивались лимфомы тимуса (Jacks et al., 1997), которые развивались медленнее, чем В-клеточные лимфомы у Ku80–/–ð53–/– мышей, тогда как у мышей Ku80–/– Т-клеточные лимфомы только изредка развивались в возрасте старше 7 месяцев (Vogel et al., 1999). Можно сделать вывод, что Ku80–/– является геном, который поддерживает интеграцию генома путем включения механизма супрессии хромосомных перестроек (Difilippantonio et al., 2000).

Наряду с Ku86/70 гетеромером, важным компонентом в механизме репарации двухцепочечных разрывов ДНК играет каталитическая субъединица ДНК-протеин киназы (DNA-PKcs). У сконструированных мышей с дефицитом DNA-PKcs было выявлено укорочение теломер по сравнению с мышами дикого типа (Espejel et al., 2004). 50 % выживаемости мыши

21

В. Н. Анисимов

DNA-PKcs-/- достигали в возрасте 13 мес., тогда как для DNA-PKcs+/+ мышей этот показатель составил 19.5 мес. До двухлетнего возраста дожили только 3 % нокаутных животных, против 23 % в контрольной группе. Главной при- чиной смерти нокаутных мышей были лимфомы тимуса, инфекция и атрофия кишок, причем лимфомы развивались у нокаутных мышей значительно раньше, чем у мышей дикого типа. У мышей DNA-PKcs–/– уже в возрасте 6—12 месяцев часто наблюдали остепороз, кифоз, снижение веса тела.

12.4.6. Мыши с выключенным геном SIRT6

Гены семейства сиртуинов (SIRTUIN — silence information regulators — регуляторы замалчивания информации). Один из генов этого семейства Sir2 открытый в 2001 г. у дрожжей, оказался непосредственно вовлеченным в регуляцию процессов старения у разных организмов (дрожжи, аскарида, дрозофила и мыши). Гены этого семейства активируются под влиянием дефицита калорий в организме, а также под действием других стрессорных факторов. Его непосредственным индуктором оказался никотинамид динуклеотид (НАД) — продукт окисления НАД-H. Идентифицированно 7 гомологов Sir2 у млекопитающих (SIRT1-SIRT7). Белки, кодируемые генами SIRT, стимулируют выработку различных сигнальных молекул, включая инсулин и IGF-1, повышают стабильность ДНК путем скручивания двойной спирали, активируют репаративные и защитные механизмы клетки, повышают скорость энергообмена и устойчивость к окислительному стрессу, угнетают функции апоптозных генов, координируют реакцию на стресс клетки и организма в целом. Координирующие эффекты генов этого семейства реализуются через белковые продукты других регуляторных генов, таких как Ð53, FOXO, Ku70, MYOD, NCoR, через гистоны H3, H4 и H1 и гены, регулирующие ацетилирование гистонов Р300 (Longo, Kenendy, 2006). Результатом экспрессии генов SIRT является увеличение продолжительности жизни клеток и организма в целом. Такой эффект сиртуинов уже показан на дрожжах, нематодах и дрозофилах, у которых избыток продукта этих генов увеличивал продолжительность жизни на 30—49 %. SIRT6 — связанный с хроматином ядерный белок, увеличивает резистентность ДНК к повреждению и подавляет геномную нестабильность в мышиных клетках, активно участвует в эксцизионной репарации оснований ДНК. У мышей с нокаутированным SIRT6 (SIRT6–/–) были отмечены очень ранние (в возрасте 2— 3 недель) проявления признаков ускоренного старения (замедление роста, потеря подкожного жира, кахексия, развитие лордокифоза и выраженной лимфопении, метаболические дефекты, включая гипогликемию и дефицит IGF-1, при нормальном уровне гормона роста) и ранняя смерть до достижения возраста 4 недель (Mostoslavsky et al., 2006). Авторы пришли к выводу, что одной из функций SIRT6 является поддержание нормальной репарации ДНК, тогда как выключение этого гена приводит к развитию множественных нарушений, весьма напоминающих ассоциированные с возрастом деге-

22

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

неративные процессы. Клетки, дефицитные по SIRT6, чрезвычайно чувствительны к действию АФК, индуцируемых ионизирующей радиацией или H2O2, а также алкилирующими агентами, но не ультрафиолетовым облуче- нием, что подтверждает роль этого гена в регуляции эксцизионной репарации оснований ДНК (Mostoslavsky et al., 2006). Было установлено, что мышиные эмбриональные фибробласты, дефицитные по Sirt1, не были подвержены клеточному старению при воздействии сублетального хронического окислительного стресса (Chua et al., 2005). При этом клеточное старение, индуцируемое онкогеном в этих клетках, индуцировалось без каких-либо проблем. Интересно, что ингибитор сиртуинов никотинамид увеличивал продолжительность репликативной жизни фибробластов человека (Lim et al., 2006). Предварительные исследования связи между функцией Sirt1 и раком свидетельствуют о том, что усиление активности Sirt1 может способствовать канцерогенезу. Так, воздействие на человеческие клетки рака молочной железы и рака легкого ингибитором Sirt1 сиртинолом вызывало остановку клеточного роста, весьма сходное с репликативным старением (Ota et al., 2006).

12.4.7. Мыши с нокаутированным геном PARP

Поли(АДФ-рибоза) и поли(АДФ-рибоза) полимераза-1 (PARP-1) были описаны около 40 лет назад, но лишь недавно показана их важная роль во многих клеточных процессах, таких как репликация, репарация, рекомбинация ДНК, клеточная пролиферация и гибель, генная транскрипция, укорочение теломер, воспаление, а также в канцерогенезе (Burkle et al., 2005; Пискунова и др., 2007). При возникновении разрывов ДНК, вызванных, в частности, алкилирующими агентами и радиацией, PARP-1 связывается с местами разрывов за счет так называемых «цинковых пальцев», расположенных в ДНК-связывающем домене и одновременно синтезирует олигоили поли(АДФ-рибозные) цепочки, ковалентно связываемые с разными акцепторными белками или с собственной молекулой путем перемещения единицы АДФ-рибозы от никотинамид аденин динуклеотида (НАД+).

Подавление активности PARP-1 ослабляет системы репарации ДНК, приводя к увеличению уровня геномной нестабильности, как известно, ускоряющей канцерогенез (Burkle et al., 2005). Для изучения роли PARP-1 в репарации ДНК, поддержании гомеостаза, канцерогенезе и старении были созданы линии мышей, нокаутные по гену PARP-1. В частности, в работах Wang et al. (1995) были использованы мыши-гибриды 129/Sv C57BL/6 и чистые линейные мыши 129/Sv (Tong et al., 2000, 2001). Инактивация гена PARP-1 производилась путем удаления 2-го экзона, разрушающего «цинковые пальцы» и препятствовавшего связыванию с ДНК. Следует отметить, что выживаемость и динамика развития спонтанных опухолей у нокаутных мышей PARP-1–/– была впервые изучена в нашей лаборатории (Пискунова и др., 2007а).

23

В. Н. Анисимов

Ò à á ë è ö à 12.5

Показатели выживаемости и продолжительности жизни у мышей PARP-1–/– è PARP-1+/+

П р и м е ч а н и е. Константа a в уравнении Гомперца: R = R0(exp)at, ãäå R0 = 3 смертность во время t = 0; MRDT — время удвоения силы смертности (mortality rate doubling time).

# — в скобках — 95 %-ный доверительный интервал. Различие с контролем статистически достоверно: *p < 0.05; ** — p < 0.0002.

Из табл. 12.5 видно, что среди нокаутных мышей средняя продолжительность жизни как всех, так и последних 10 % животных, была статисти- чески достоверно короче, чем у мышей «дикого типа». Такая же тенденция прослеживалась при анализе максимальной продолжительности жизни и медианы. При этом скорость старения a у нокаутных животных была выше, а показатель времени удвоения силы смертности — ниже, чем в контроле, причем выявленные различия были статистически достоверными (рис. 12.1).

Из табл. 12.6 можно видеть, что у нокаутных мышей имеет место отчетливое ускорение возрастных процессов многих систем организма. Обнаруженное нами сокращение продолжительности жизни нокаутных животных можно объяснить накоплением нарушений макромолекул, включая ДНК, вызванных ослаблением системы репарации ДНК, в которой PARP играет значительную роль. Стимуляция старения и укорочение жизни показаны на различных мышиных моделях с дефектами нуклеотидной эксцизионной репарации (de Boer, Hoeijmakers, 1999). В ряде работ показана прямая корреляция между продолжительностью жизни различных видов млекопитающих и способностью их клеток к поли(АДФ-рибоз)илированию, обусловленной активностью PARP-1 (Burkle et al., 2005). В лимфоцитах столетних людей активность PARP-1 была значительно выше, чем у 20—70-летних (Muiras, 2003).

В нашем исследовании при аутопсии опухоли обнаружены у 53 из 73 нокаутных мышей (73 %) и 79 из 103 контрольных животных (77 %).

24

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

Рис. 12.1. Кривые выживаемости (À) и возникновения спонтанных опухолей (Á) у мышей PARP-1+/+ è PARP-1–/–.

По оси абсцисс — возраст, сут.; по оси ординат: À — количество мышей, %; Á — количество мышей с опухолями, %.

Средний возраст нокаутных животных с опухолями был значительно меньше, чем у животных «дикого типа» (612 ± 19.2 и 706 ± 17.6 суток соответственно, р < 0.0002). Следует отметить, что среди нокаутных мышей значи- тельно чаще (р < 0.05) встречались фатальные опухоли, приводившие к гибели животных. Подобные новообразования обнаружены у 49 мышей

25

Â.Н. Анисимов

Òà á ë è ö à 12.6

Влияние нокаута гена PARP-1 на показатели биологического возраста и старение у самок мышей 129/Sv (Piskunova et al., 2008)

26

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

PARP-1–/– (67 %) и 48 мышей PARP-1+/+ (47 %). Таким образом, у нокаутных мышей опухоли развивались в более раннем возрасте и отличались более агрессивным ростом, по сравнению с контролем (рис. 12.1). При микроскопическом исследовании в обеих группах животных выявлен широкий гистологический спектр опухолей (табл. 12.7). Большинство новообразований составляли неэпителиальные опухоли матки, основная часть которых была представлена саркомами плеоморфного строения, имевшими скорее всего миогенное происхождение, с обилием сосудистых полостей. У нокаутных мышей сравнительно чаще возникали злокачественные новообразования. Прежде всего это касается злокачественных опухолей матки, аденокарцином легкого и гепатоцеллюлярных карцином. В целом в подопытной группе 59 из 82 опухолей (72 %) были злокачественными, тогда как в контрольной группе — лишь 49.2 % (59/120). Выявленные различия были статистически достоверными (р < 0.05). Все это подтверждает наши наблюдения при аутопсии о более агрессивном характере опухолевого процесса у нокаутных мышей. Сравнение латентных периодов развития опухолей различ- ных гистологических типов в обеих группах животных выявило статистиче- ски достоверное уменьшение этого показателя у нокаутных мышей — носителей злокачественных лимфом и гепатоцеллюлярных карцином, хотя и при других видах новообразований наблюдалась подобная тенденция (Пискунова и др., 2007).

В целом проведенные исследования свидетельствуют о том, что выклю- чение гена репарации ДНК PARP-1 приводит к ускорению старения, сокращению продолжительности жизни, более раннему и более агрессивному развитию опухолей (табл. 12.7). Это подтверждает представления о роли репарации ДНК в механизмах канцерогенеза и старения.

12.4.8. Мутации в гене, контролирующем метилирование ДНК

Гетерозиготные мыши с частично нокаутированным геном Dnmt1, контролирующим метилирование ДНК (мыши Dnmt1+/–) характеризовались сохранением иммунных функций Т-лимфоцитов и уровня метилирования ДНК, тогда как у мышей дикого типа наблюдалось развитие аутоиммунных процессов, иммуностарения и гипометилирование ДНК. При этом выживаемость мутантных и контрольных мышей не различались, тогда как у мышей Dnmt1+/– чаще, чем у мышей Dnmt1+/+ наблюдалось отложение аполипопротеина AII в тонкой кишке и развитие амилоидоза (Ray et al., 2006). Средняя продолжительность жизни 45 мышей Dnmt1+/– составила 29.0 мес., а 52 контрольных мышей — 29.3 мес. Частота развития и спектр возникших спонтанных новообразований, среди которых доминировали лимфомы, в двух сравниваемых группах также не различались, как не различалась достоверно и продолжительность жизни животных с опухолями. Однако в другой работе, у мышей, несущих гипоморфный аллель ДНК метилтрансферазы (Dnmt1), у которых экспрессия Dnmt1 составляла 10 % от уровня мышей

27

Â.Н. Анисимов

Òà á ë è ö à 12.7

Сведения о развитии опухолей различного гистологического типа у мышей PARP-1–/– è PARP-1+/+

Ï ð è ì å ÷ à í è å. à — количество мышей с опухолями данной локализации и гистологического типа. Различие с контролем статистически достоверно: * — ð < 0.05; ** — ð < 0.01; *** — ð < 0.001; # — p < 0.0002.

28

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

дикого типа и наблюдалось существенное гипометилирование генома во всех тканях, было отмечено развитие карликовости и возникновение в возрасте 4—8 месяцев агрессивных Т-клеточных лимфом, характеризовавшихся высокой частотой трисомии хромосомы 15 и приводивших к существенному укорочению продолжительности жизни мышей (Gaudet et al., 2003). Эти данные свидетельствуют о том, что гипометилирование играет причинную роль в возникновении опухолей, возможно, промотируя хромосомную нестабильность.

12.4.9.Трансгенные мыши

ñсуперэкспрессией гена Cu, Zn-супероксид дисмутазы

Âсоответствии со свободнорадикальной теорией старения предполагается, что при старении в клетках увеличивается частота повреждений, вызываемых свободными радикалами, прежде всего активными формами кислорода, тогда как супероксид дисмутаза (СОД), каталаза, глютатионпероксидаза, a-токоферол, аскорбиновая кислота и некоторые другие ферменты и антиоксиданты защищают клетки от окислительного стресса

(см. главу 2).

Ген супероксид дисмутазы (hSOD-1) способствует превращению O–2 • â H2O2 è Î2. У человека он локализован в хромосоме 21 (g22,1), и его избыточная экспрессия выявлена у пациентов с синдромом Дауна. У этих больных наблюдается задержка умственного развития, врожденный порок сердца, иммунодефицит и ускоренное старение. Для исследования потенциальной роли SOD-1, сверхэкспрессированного при синдроме Дауна, были получены и исследованы две линии трансгенных мышей с hSOD-1, их морфологические особенности на ультраструктурном уровне, воздействие суперэкспрессии hSOD-1 на микросреду тимуса (Nabarra et al., 1997). У той и другой линии мышей отмечено, что изменение клеточной архитектуры и морфологии ассоциируется с отложением липидов, симптомами преждевременной инволюции тимуса. Наблюдалась дезинтеграция волокнистой сети

âэкстрацеллюлярном и интрацеллюлярном матриксе. Эти наблюдения ставят вопрос о связи между суперэкспресией SOD-1 и различными морфологическими изменениями, связанными с ранней инволюцией тимуса, которые наблюдались у трансгенных SOD-1 мышей. Предполагается, что иммунодепрессия и инволюция тимуса у пациентов с синдромом Дауна связаны с действием гена SOD-1. Избыточная экспрессия этого человеческого гена у трансгенных мышей способствовала увеличению активности пероксидазы в мозгу животных (Ceballos Picot, 1993). В то же время у мышей, несущих hSOD-1, с возрастом в мозговой ткани повышался уровень 8-окси-2R-дезок- сидгуанидина по сравнению с контролем дикого типа (Cardozo Pelaes et al., 1998). Выживаемость 24 самцов мышей, трансфецированных геном hSOD, сравнивали с 11 контрольными мышами дикого типа в течение 19 месяцев. Не наблюдалось различия по продолжительности жизни, локомоторной ак-

29

В. Н. Анисимов

тивности или дофаминовой чувствительности в головном мозге в обеих группах (Gallagher et al., 2000). 5 из 24 трансгенных мышей и 5 из 11 контрольных пали позже 19 месяцев (p < 0.05).

Мыши со сниженной экспрессией Mn-cупероксиддисмутазой (Sod2+/–) характеризовались значительной чувствительностью тканей к окислительному стрессу в течение всей жизни и увеличенной частотой развития новообразований, однако средняя продолжительность их жизни не отличалась от таковой в контроле. При этом не было выявлено и различий в величине некоторых биомаркеров старения (van Remmen et al., 2003).

Для изучения роли гидроперекиси в повреждении ядерной ДНК были сконструированы трансгенные мыши двух типов. Одна из конструкций содержала избыточный ген каталазы человека дикого типа, локализовавшийся в пероксисомах, тогда как вторая позволяла каталазе воздействовать непосредственно на ядро (Schriner et al., 2000). Несмотря на повышенный уровень каталазы, на обеих моделях не было отмечено изменений в уровне маркера оксидативного повреждения ДНК 8-оксидезоксигуанина по сравнению с однопометным контролем. Данные о выживаемости мышей и частоте у них какой-либо патологии не приводятся.

Специфическая ДНК-гликозилаза, являющаяся продуктом гена OGG1, удаляет 8-оксидезоксигуанин из клеток эукариот. Гомозиготные нокаутные ogg1–/– мыши были вполне жизнеспособны, но накапливали существенно повышенный уровень 8-оксидезоксигуанина в геноме (Klungland et al., 1999). Повышение частоты спонтанных мутаций в непролиферирующих тканях было, хотя и достоверно, но довольно умеренно выражено. Авторы утверждают, что у этих мышей не развивается никакой патологии, включая рак. Однако этот вывод сделан на основании результатов аутопсии и патоморфологического исследования только 2 (!) мышей, умерщвленных в возрасте 8 и 11 месяцев соответственно, что явно недостаточно для какого-ли- бо суждения.

12.4.10.Мыши с нокаутированным геном пероксиредоксина Prdx1

Óгомозиготных мышей, с выключенным геном Prdx1, кодирующим небольшие антиокислительные белки пероксиредоксины, содержащие каталитические остатки цистеина и использующие тиоредоксин как донор электронов, было отмечено существенное укорочение продолжительности жизни по сравнению с контролем дикого типа, сопровождавшееся увеличением частоты развития новообразований (Neumann et al., 2003). Поскольку частота опухолей увеличивалась также и у гетерозиготов Prdx1+/–, авторы полагают, что этот ген может являться антионкогеном. В этой же работе было показано, что эмбриональные фибробласты мышей Prdx1–/– имеют сниженный пролиферативный потенциал in vitro и повышенную чувствительность к окислительному повреждению ДНК.

30