2 курс / Нормальная физиология / Физиология_крови_Липунова_Е_А_,_Скоркина_М_Ю_

Реактивность клетки, как структурной единицы живой системы, оценивается диапазоном ее функциональной активности, в том числе лабильностью биохимических процессов и способностью к ауторегуляции. Ауторегуляция (авторегуляция) – местная, не зависящая от эфферентной иннервации и действия приносимых с кровью веществ, способность клетки (ткани) обеспечивать адекватный, соответствующий воздействию, уровень метаболической активности и адаптации благодаря наличию универсальных филогенетически древних мембранных рецепторных структур. На клеточном уровне процесс адаптации к изменению средовых факторов, действию сигнальных молекул реализуется с участием ионтранспортирующих систем. При этом реакция клеток зависит от типа и соотношения рецепторов, экспрессированных на мембране, вторичных посредников, субстратов, киназ и пр. (Дж. Теппермен, Х. Теппермен, 1989).

Изучение механизмов, оценки и прогнозирования индивидуальной реактивности организма и его резистентности к действию различных экстремальных факторов не утратило актуальности и связано с решением ряда как теоретических, так и сугубо практических вопросов. При исследовании неспецифической реактивности и резистентности млекопитающих животных и человека к экстремальным физическим факторам обнаружена ведущая роль в формировании их регуляторных систем, главная из которых – центральная нервная система (Г.Н. Кассиль, 1981; И.Б. Ушаков, А.С. Штемберг, 2007). Однако если в условиях физиологической нормы нервная регуляция является ведущей, то при возмущающих воздействиях, стрессовых ситуациях и сопутствующих существенных нарушениях гомеостатических механизмов состояние самой нервной системы становится зависимым от химических сдвигов в составе и свойствах как общей внутренней среды, так и непосредственной – микросреды клеток.

Исследование свойств клетки – реактивность и резистентность

– актуально, поскольку на основе гипотезы о функциональной надежности регуляторных систем при применении интегративного показателя клетки позволяет разрабатывать методы прогнозирования индивидуальной (и видовой)резистентности организма.

В наших исследованиях, на основе генетически детерминированных геометрических характеристик эритроцита – объем, площадь поверхности мембраны и толщина (высота) – разработа-

191

на модель оперативного выявлении качественных изменений в эритроцитарной популяции, происходящих при физиологической и репаративной регенерации системы красной крови, что дает возможность прогнозировать развитие адаптационных или патологических процессов в организме (патент РФ на изобретение № 2224235, 2004; патент РФ на изобретение № 2234701, 2004).

Особого внимания заслуживают способы оценки функционального состояния организма по степени реактивности и резистентности клеток крови к гемолитикам различной природы, основанные на скорости вовлечения в гемолитический процесс разновозрастных субпопуляций эритроцитарной системы. Установлено, что скорость клеточного ответа на воздействия зависит от функционального состояния системы эритрона. Использование точных математических параметров, отражающих клеточную морфологию (патент РФ на изобретение № 2234701, 2004), позволило нам создать высокоспецифичный и информативный способ оценки активности эритропоэза (патент РФ на изобретение № 2268463, 2006).

Изучая с помощью метода лазерной дифракции распределение клеток, в том числе и крови, по размерам и форме, А.В. Сыроешкин и соавт. (1999, 2002) разработали новые подходы к исследованию патофизиологии клетки для диагностики и мониторинга заболеваний и сформулировали общую теорию клеточного формообразования.

Для клеток крови интегральным и регулируемым показателем служит объем. При изменении осмоляльности цитоплазмы или интерстициальной жидкости возрастает скорость ионных потоков, ответственных за восстановление объема клетки после первичного сжатия – регуляторное увеличение объема (regulatory volume increse – RVI), или набухания – регуляторное уменьшение объема (regulatory volume descrease – RVD) (С.Н. Орлов, Т.Г. Гурло, 1991).

Время восстановления клеточного объема зависит от активации ионтранспортирующих систем (B.D. Cherksey et al., 1980; A.A. Mongin, S.N. Orlov, 2001) и абсолютных величин неттопотоков ионов (S. Eskelinen, W.T. Coakley, 1986; M. Berenbrink et al., 1997). В проведенных нами исследованиях по изучению кинетических характеристик объемзависимых транспортных систем

192

эритроцитов лягушек в гипоосмотической среде установлено регуляторное восстановление объема клеток после первичного набухания в 0,2% растворе хлорида натрия через 50 с инкубации (М.Ю. Скоркина и соавт., 2004).

Регуляция структурно-функционального состояния эритроцитов основана на взаимосвязи процессов трансмембранного транспорта ионов, изменения формы, объема и механических свойств клеток. Благодаря высокоорганизованной динамической мембране эритроциты способны регулировать объем и сохранять свою жизнеспособность (Е.А. Липунова и соавт., 2004а).

3.5.1. Объем клеток и его регуляция

Живая клетка – подвижная саморегулирующаяся система, ее внутренняя организация поддерживается активными процессами, направленными на устранение, предупреждение или сглаживание сдвигов, вызванных стимулами из внешней или внутренней среды. Способность возвращаться к исходному состоянию (объему) после отклонений от некоторой величины, вызванных возмущающим фактором, – особое преимущество клетки (Г.Н. Кассиль, 1981). Объем эритроцита – структурно-функциональная характеристика, отражающая его поведение и способная изменяться соответствующим образом при различных воздействиях благодаря способности клетки к ауторегуляции. Объем клетки служит относительным показателем эффективности ее метаболизма и функционирования конкретных транспортных систем, активирующихся при сжатии и набухании. Одна из ведущих причин, вызывающих колебания объема, – изменение тоничности цитоплазмы и внеклеточной среды. Флуктуации тоничности цитоплазмы возникают вследствие модификации активности мембранассоциированных ионных каналов, вовлеченных в транспорт основных осмотически активных катионов (С.Н. Орлов и соавт., 1988). Степень тоничности цитоплазмы зависит от метаболизма клетки – энзиматически регулируемого процесса. Как показали исследования (Д. Мецлер, 1980; Э. Бойтлер, 1981), эритроцит содержит более 140 энзимов, контролирующих синтез и распад внутриклеточных макромолекул.

Наиболее полно исследована способность к регуляции объема клеток мозгового вещества почек, в филогенезе адаптирован-

193

ных функционировать в условиях физиологической гипо- и гипертоничности и адекватно реагировать на флуктуации осмоляльности в достаточно широком диапазоне величин (Ю.В. Наточин, 2000; Физиология водо-солевого обмена..., 1993; M.B.Burg, 1995). Способность регулировать объем свойственна всем растительным и животным клеткам – от бактерий до клеток млекопитающих и человека (R. Kinne, 1993).

В последние годы в зоне внимания исследователей – изучение механизмов, позволяющих клеткам крови изменять и регулировать объем. Эти вопросы непосредственно взаимосвязаны с раскрытием кинетики объемзависимых транспортных систем, механизмов внутриклеточной сигнализации, выявлении специализированного или специфического сенсора, воспринимающего информацию об изменении объема клетки, и последующего его усиления и трансмиссии на соответствующую ионтранспортирующую систему (С.В. Конев, 1987; В.А. Ткачук, 1987; С.Н. Орлов, Т.Г. Гурло, 1991; С.Н. Орлов, К.Н. Новиков, 1996; А.Г. Камкин и соавт., 2006). При изменении осмоляльности экстрацеллюлярной жидкости возрастает скорость объемчувствительных ионных потоков: при уменьшении объема клетки активируются

Na+,K+,2Cl--котранспорт, Na+/H+-обмен, Cl-/HCO3--обмен; при увеличении объема – активируются K+,Cl--котранспорт, K+- и Cl--каналы и Cl-/HCO3--обмен (С.Н. Орлов, Т.Г. Гурло, 1991; K. Strange et al., 1996; J.A. Hernandez, C. Ernesto, 1998). В послед-

нее десятилетие были открыты белки аквапорины, формирующие в липидном слое клеточной мембраны каналы для движения воды по осмотическому градиенту (Л.Н. Иванова, Е.И. Соленов, 2005). Распространенность этого типа каналов в биологических мембранах животных различных уровней организации пока не установлена.

Исследованиями, выполненными на эритроцитах человека, показано участие K+-(Ca2+)-каналов в изменении объема клеток (И.В. Петрова и соавт., 2005). Основной системой поддержания постоянного клеточного объема выступает Na+,K+,2Cl-- котранспорт, который в зависимости от соотношения градиентов Na+ и K+ обеспечивает их поток в клетку (и вызывает набухание) или наружу (сжатие клетки).

Скорость проникновения ионов через мембрану определяется такими ее свойствами, как толщина, значение диэлектриче-

194

ской проницаемости, наличие фиксированных диэлектрических зарядов на поверхности, знак и плотность их расположения на мембране, размеры и число пор в мембране, наличие фиксированных зарядов в канале (Г.А. Исаева и соавт., 2004). В объемную регуляцию интранспортирующих систем вовлечены системы внутриклеточной сигнализации, гормоны, биологически активные вещества, метаболиты. Особая роль отводится ионам кальция (А.А. Галкин, В.С. Демидов, 2007). В литературе обсуждается информация об увеличении и уменьшении концентрации внутриклеточного кальция в эритроцитах Amphiuma соответственно при набухании и сжатии клеток (P.M. Cola et al., 1986).

Экспериментами, направленными на изучение неспецифических механизмов клеточного ответа на кальциевую сигнализацию, выполненных в нашей лаборатории, установлено регуляторное возрастание объема (RVD) эритроцитов в гипотонической среде после кальциевой нагрузки (5·10-6 ммоль·л-1) через 30 с инкубации. Интенсивность перестроек морфологического профиля эритроцитов, оцениваемая по коэффициенту резервной поверхности, лежит в пределах 300 с, когда между клетками опытной и контрольной аликвот зафиксированы достоверные различия. Мы отмечаем высокую реактивность эритроцитарной системы лягушек на кальциевые сигналы. Ионы Ca2+, как древние регуляторы внутриклеточных процессов, выступают посредниками в передаче сигналов от внешних факторов, одновременно генерируя внутриклеточную перестройку биохимических систем, адекватную воздействиям и направленную на реализацию адаптивных механизмов (Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина, А.С. Зеленцова, 2007; М.Ю. Скоркина, 2007).

Основной механизм ауторегуляции клеточного объема – изменение внутриклеточного метаболизма, ведущее к сдвигам концентрации внутриклеточных компонентов (M.M. Garner, M.B. Burg, 1994; J.C. Summers et al., 1997). В объемной регуляции уча-

ствуют ферменты, контролирующие уровень циклических мононуклеотидов, диацилглицерола, инозитолфосфатов (A.A. AbdelLatiff, 1986). Рост внутриклеточной концентрации циклических мононуклеотидов или диацилглицерола активирует протеинкина-

зы А (В.А. Ткачук, 1987) и С (A.A. Abdel-Latiff, 1986), а повыше-

ние концентрации инозитолтрифосфата высвобождает Ca2+ из внутриклеточных депо, что стимулирует (Ca2++кальмодулин)-

195

зависимую протеинкиназу (J.L. Eveloff, D.G. Warnock, 1987),

участвующих в фосфорилировании мембранных белков с характерным сдвигом функциональной активности клетки. В.А. Галенок и соавт. (1987), С.Н. Орлов, Т.Г. Гурло (1991), Е. Лапетина (E.G. Lapetina et al., 1981) отмечают роль метаболитов архидоновой кислоты (простагландины, простациклины, лейкотреины) как вторичных месенжеров в регуляции клеточного объема.

Роль гормонов в регуляции клеточного объема обусловливается их способностью модифицировать работу ионных переносчиков и изменять состояние цитоскелета (С.В. Конев, 1987; С.Н. Орлов, К.Н. Новиков, 1996; Я.Ю. Комиссарчик, 1998; Н.Н. Мелиди и соавт., 1998; Ю.В. Наточин, 1998). Макромолекулы цитоскелета обеспечивают высокую чувствительность клетки к измене-

нию объема (H. Venter et al., 1991; J. Chen et al., 1994; M.B. Burg, 1994; B.R. Doctor et al., 1997) и препятствуют свободному току воды в клетку (Е.А. Смирнова, 1988; Е.А. Смирнова и соавт., 1987). Для объемной регуляции клетки потенциально важны белки цитоскелета: они придают мембране свойства напряженности и метастабильности, кроме того, актин и актиноподобные белки, обладая сократимостью, могут маскировать и модифицировать осмотическое поведение клетки (J.W. Milis, 1987). Следовательно, нормализация объема зависит не только от концентрации ионов, создаваемой работой соответствующей транспортной системы, но также от упруго-эластических характеристик мембраны и подмембранных белков (А.А. Галкин, Б.И. Ходоров, 1988; С.Н. Орлов, Т.Г. Гурло, 1991).

В физиологических условиях осмотическая стойкость клеток – величина относительно постоянная, но понижается при старении клетки, повышении ее функциональной активности, в условиях патологии или экстремальных воздействиях (А.А. Болдырев, 1985, 1990). При измененных условиях основная причина мембранного разрыва – биохимические повреждения (J. Chen, L.J. Mandel, 1997).

При повышении осмоляльности среды происходит гипертоническое сжатие клетки. В этих условиях как регуляторы клеточного объема выступают осмолиты – органические молекулы, не влияющие на электрические характеристики клеток. Это полиолы (сорбитол, миоинозитол), аминокислоты (аланин, таурин), метиламины (бетаин, глицерофосфохолин) (С.Н. Орлов, К.Н. Новиков, 1996).

196

Повышение осмоляльности цитоплазмы ведет к набуханию и увеличению объема эритроцитов. Так, у больных сахарным диабетом нарушен метаболизм глюкозы; интенсификация полиолового пути приводит к синтезу и накоплению сорбитола в клетках вследствие малой для него проницаемости мембраны. Концентрация этого осмотически активного вещества в эритроцитах может возрастать в 3–5 раз, что приводит к резкому снижению фильтруемости клетки. Кроме того, при сахарном диабете активируется альдозоредуктаза, катализирующая восстановление глюкозы до сорбитола (В.А. Галенок и соавт., 1987; Биохимия человека, 1993; Е.И. Соколов, 2002; O. Carandente et al., 1982; J.V. Munt et al., 1990). Поскольку реакция идет с поглощением энергии, высвобождающейся при расщеплении АТФ, усугубляется дефицит макроэргов в клетках. Такие изменения в эритроцитах снижают реологические свойства крови, нарушают кислородный режим (E. Altomaze et al., 1992) и усугубляют гипоксию (А.С. Ефимов и соавт., 1984).

В последние годы ученые все чаще используют методики экспозиционных нагрузок (гипо- и гипертонические растворы электролитов и неэлектролитов) в качестве функциональных проб, характеризующих способность клеток к реализации потенциальных нагрузок (В.И. Медведев, 1982; М.З. Федорова, 2001; М.З. Федорова, В.Н. Левин, 2001; А.В. Муравьев и соавт., 2005, 2007; Е.А. Липунова и соавт., 2004, 2005; И.А. Тихомирова и со-

авт., 2005).

3.5.2. Резистентность клеток крови

Высокие барьерные свойства эритроцитарных мембран определяются липидным бислоем (Е.А. Черницкий, А.В. Воробей, 1981). Непрерывность липидного бислоя мембраны в процессе жизненного цикла клетки может нарушаться с образованием структурных дефектов типа сквозных гидрофильных пор. Примером дестабилизации мембраны эритроцитов выступает гемолиз, при котором мембрана растягивается и в ней появляются гидрофильные поры вследствие латеральных флуктуаций плотности поверхности. При определенном пороговом уровне натяжения мембраны гидрофильные поры обеспечивают выход гемоглобина и низкомолекулярных веществ. Превращение поры в гидрофильную обусловлено переориентацией липидных молекул

197

(Ю.А. Чизмаджев, 2000). Выход веществ сопровождается снижением разности осмотического давления, натяжение мембраны уменьшается, и поры залечиваются. Однако, если размер поры выше критического значения, происходит нарушение целостности мембраны (В.Ф. Антонов, 1998). При гипоосмотическом «шоке» полного механического разрушения клетки не происходит, поскольку белки цитоскелета обеспечивают клетке способность сохранять форму, при этом образуется «тень» эритроцита

(В.Ф. Антонов, 1996).

Резистентность отражает структурно-функциональное состояние мембраны, имеет важное диагностическое значение, что связано с решением одной из важнейших задач физиологии и патологии системы крови – изучение качественного состава функционирующих гемоцитов.

Резистентность эритроцитов оценивают методом постановки тестов на механический, перекисный, мочевинный, глицериновый гемолиз, а также в модельных опытах с экспозицией клеток в гипо- и гипертонических средах.

В клинической гематологии и научных исследованиях наиболее распространено определение осмотической и кислотной резистентности – устойчивости эритроцитов в гипотонических растворах и растворах кислых гемолитиков. Выбор методики определяется целью исследования и решаемыми задачами, поскольку каждый из названных видов гемолиза обусловлен функционированием одной или нескольких транспортных систем клетки.

Методы дисперсионного анализа, характеризующие качественный состав эритроцитов, были разработаны И.И. Гительзоном и И.А. Терсковым. Принцип метода состоит в фотоэлектрической регистрации убыли числа эритроцитов в процессе гемолиза, развивающегося в стабильных условиях. Опыты, проведенные с гемолитиками различного механизма действия, позволили авторам предложенного метода сформулировать следующие представления о кинетике гемолиза. Стойкость клетки, определяемая по выходу гемоглобина, является результирующей трех процессов: 1) времени, необходимого для преодоления гемолитиком барьера мембранной непроницаемости; 2) скорости распада внутриклеточных структур; 3) времени, в течение которого механическая прочность мембраны противостоит нарастающему осмотическому давлению внутри клетки (И.И. Гительзон, И.А. Терсков, 1959).

198

Осмотический тип гемолиза не приводит к химическим изменениям содержимого эритроцита. При осмотическом гемоглобинолизе диффундирует лишь свободная фракция гемоглобина; при усилении гипотонии приостанавливается его выход, т. к. при радиусе молекулы около 3,25 нм свободный выход из клетки возможен только в условиях образования дефектов в мембране. Установлено, что при осмотическом типе гемолиза по мере выхода гемоглобина размеры разрыва мембраны уменьшаются, что указывает на ее способность к самовосстановлению (З.И. Кружецкая, А.В. Лонский, 1994).

Химический (кислотный) тип гемолиза включает ряд последовательно протекающих стадий: предгемолитическая, гемоглобинолиза, строматопороза, строматолиза. Главный критерий предгемолитической стадии – выход ионов калия в окружающую среду и сферуляция эритроцитов. Гемоглобинолиз протекает в зависимости от свойств гемолитика. Так, при химическом гемоглобинолизе происходит нарушение физико-химических свойств связанного гемоглобина вследствие распада гемолипостроматинового комплекса. На стадии строматопороза под влиянием, например, концентрированного сапонина происходит нарушение морфологической целостности эритроцита. Полная деградация клеточных структур (строматолиз) наступает при действии холе- во-, дезоксихолево-, олеиновокислого натрия.

Гемолитическое влияние на клетку сильных кислот и оснований обусловлено действием высокореакционных ионов Н+ и ОН-, вызывающих повреждение мембраны, повышение внутриклеточного осмотического давления, которое приводит к сферуляции эритроцита; при достижении критического объема клетка подвергается гемолизу.

В настоящее время активно исследуются динамика формы, разрушения мембраны и кинетика гемолиза эритроцитов в гипоосмолярной и кислой среде методами микрореоскопии (В.В. Усынин и соавт., 2005).

Наиболее полно явление резистентности эритроцитов изучено у человека и млекопитающих животных. Метод построения эритрограмм достаточно активно используется для диагностики различных заболеваний (Л.Н. Катюхин, М.Н. Маслова, 1984; Клиническая гематология, 1985; Исследование системы крови в клинической практике, 1997; А.В. Трикуленко, У.В. Панишко,

199

1999; Е.В. Ройтман и соавт., 2001; Д.Ф. Шакиров и соавт., 2003; М.М. Фазлыев, А.Ж. Гильманов, 2005).

Термин «эритрограмма» и методика ее построения были введены И.И. Гительзоном и И.А. Терсковым, ими же впервые была описана архитектоника (форма) эритрограммы. Типичная эритрограмма человека и млекопитающих животных представлена одновершинной кривой с максимумом у человека на 0,50-0,44 % NaCl (у кролика – от 0,60 до 0,5% NaCl) и крутыми спусками в стороны бóльшей или меньшей стойкости (И.И. Гительзон, И.А. Терсков, 1956). Форма эритрограммы в норме постоянна в пределах небольших физиологических вариаций и отражает, таким образом, закономерное количественное соотношение между группами эритроцитов различной стойкости, сохраняющееся при нормальной жизнедеятельности организма.

Многочисленными экспериментами установлена зависимость между физиологическим состоянием организма и стойкостью эритроцитов к гемолитикам разного генеза, не исключая метаболиты.

Наиболее характерное изменение эритрограмм в ходе регенерации крови – распад на две вершины и их дальнейшая эволюция. Появление максимумов связывают с выбросом костным мозгом в кровоток молодых форм эритроцитов.

Отмечены внутривидовые и межвидовые различия кислотной резистентности (С.Ю. Балакирева, М.М. Яшина, 1969), изменения резистентности клеток в условиях гипоксии, гипотермии и гиперкапнии (Г.Н. Акоева и соавт., 1977), получены эритрограммы метгемоглобиновых эритроцитов (В.В. Овчинников, 1967), установлена роль липидов в распределении эритроцитов на кислотной эритрограмме (М.Д. Бриллиант, А.И. Воробьев, 1967).

В современной клеточной биологии активно исследуются цитофизиологические особенности устойчивости эритроцитов к коллоидно-осмотическому лизису у представителей различных филогенетических групп животных. Ученые приходят к выводу о снижении осмотической стойкости эритроцитов в ряду земноводные – птицы – человек. Причем реактивность клеток к порообразующему гемолитику в этом ряду обратная, т. е. эритроциты лягушки более чувствительны к воздействию порообразующего гемолитика, чем клетки птиц и человека (С.В. Бессонова и соавт., 2004). Полученные результаты ученые объясняют несовершен-

200