4 курс / Общая токсикология (доп.) / Актин_миозиновое_взаимодействие_в_миокарде_в_норме

(Екатеринбург, 2019), Всероссийской научно-практической конференции

«Научное сопровождение деятельности учреждений Роспотребнадзора»

(Екатеринбург, 2019) и Международной научной конференции «Актуальные вопросы органической химии и биотехнологии» (Екатеринбург, 2020).

Личный вклад автора заключается в экстрагировании белков для экспериментов – миозина и нативного филамента, планировании и проведении экспериментов в in vitro motility assay и электрофоретического разделения белков, а также определении уровня фосфорилирования белков, анализе и интерпретации полученных данных, а также в подготовке научных публикаций.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 19

работ, в том числе 8 статей (из них 5 в журналах, индексируемых в WoS и SCOPUS и 3 в журналах из списка ВАК РФ) и тезисы 11 докладов на отечественных и международных конференциях. Кроме того, был получен один патент, опубликована научно-популярная статья на английском языке и сделан один научно-популярный доклад.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, материалы и методы исследования,

результаты и их обсуждение, выводы и список использованной литературы,

который включает 201 источник. Работа представляет собой 137 страниц печатного текста, содержит 13 рисунков и 16 таблиц.

Благодарности. Автор благодарен Клиновой С.В. за подготовку и моделирование хронической интоксикации крыс всех групп, Набиеву С.Р. за консультации, обсуждение результатов, сотрудничество и помощь в проведении экспериментов в in vitro motility assay.

11

хвоста (C-конец) и глобулярной головки (N-конец). С-концевые части двух тяжелых цепей миозина образуют двойную α-спираль в результате периодических повторов гидрофобных и заряженных аминокислотных остатков [43–48].

Глобулярная головка миозина содержит активный центр АТФазы и участки связывания актина. В области шейки – участка, соединяющего головку со стержневой частью миозина – имеются два консервативных IQ-

мотива, которые представляют собой амфифильную α-спираль с сайтами связывания легких цепей миозина. В каждой молекуле сердечного миозина с двумя тяжёлыми цепями в области шейки ассоциированы 4 лёгкие цепи массой 18-28 кДа – две существенные (ELC) и две регуляторные (RLC),

которые при генерации силы головкой миозина выполняют регуляторную и стабилизирующую функцию. Существенная и регуляторные цепи занимают первый и второй IQ мотивы в области шейки миозина. Известно, что существует зависимость – чем длиннее шейка головки миозина, тем эффективнее она перемещает актин [43,45,46,49,50]. Обе легкие цепи – RLC и

ELC – имеют структуру, тесно связанную со структурой семейства кальций-

связывающих белков EF-hand, таких как тропонин С и кальмодулин. Однако,

в отличие от других белков EF-hand, RLC имеет только один Ca2+/Mg2+-

связывающий EF-домен между аминокислотами 37 и 48 [50].

RLC (~19 кДа) является членом суперсемейства EF-hand, которое представляет собой структурный домен спираль-петля-спираль. N-концевой домен RLC сходен по структуре с кальмодулином и охватывает область между аминокислотами Asn825 и Leu842 на С-концевом участке миозина S1 (субфрагмент 1). С-концевой домен RLC нековалентно связывается с C-

концом субфрагмента миозина S1 в области между Glu808 и Val826 [51].

Количество фосфорилируемых серинов в RLC различается в зависимости от вида животного и ткани, что указывает на присутствие уникальных тканеспецифичных изоформ, таким образом, предоставляя возможности для различных функций. Хотя изоформы RLC схожи по структуре, в частности, в

13

двухвалентных сайтах связывания катионов и проксимальных фосфорилируемых серинов как в гладких, так и в полосатых мышцах, они имеют относительно низкое сходство последовательностей (~57%), что свидетельствует о функциональной дифференциации [50,52].

С помощью протеолитических ферментов трипсина и химотрипсина из миозина можно выделить два фрагмента – лёгкий и тяжёлый меромиозин.

Лёгкий меромиозин, состоящий из хвоста молекулы, весит около 140 кДа, в то время как более крупный тяжелый меромиозин весит около 340 кДа и включает в себя головку, небольшую часть хвоста и лёгкие цепи. С помощью папаина возможно дальнейшее расщепление тяжёлого меромиозина на субфрагменты S1, который включает парные головки тяжёлых цепей миозина и четыре лёгкие цепи, и S2, включающий небольшую часть хвоста [43].

Миозины сердечной и скелетной мышц играют ключевую роль в сокращении, превращая свободную энергию АТФ в механическую работу – передвижение актина [53].

1.1.3 Изоформы сердечного миозина и их свойства

Один из важнейших моментов в истории молекулярных исследований сердца – 1978 год, когда была опубликована статья, автор которой – австралийский учёный Joseph Hoh – впервые разделил сердечный миозин крысы в нативном пирофосфатном геле. Он идентифицировал две предсердные изоформы миозина – А1 и А2 – и три желудочковые – V1, V2 и

V3. Буквы соответствуют расположению миозина в отделах сердца: А – atrial

(предсердный) и V – ventricular (желудочковый) [54,55].

В настоящее время известно, что аминокислотные последовательности изоформ миозина сердца млекопитающих V1 и V3 идентичны более, чем на

93%. Существует 127 неидентичных аминокислотных остатков (из 1938),

большинство из которых локализуются в основании каталитического домена миозина на стыке с существенной лёгкой цепью (остатки 32-36), у входа в АТФ-связывающий карман (210-214) и в поверхностной петле 1 (349-351), в

поверхностной петле 2, около актин-связывающего сайта (619-641), в области

14

шейки (800-810) и в субфрагменте 2 (1088-1094) [8,56]. Сократительные свойства мышечных волокон во многом определяются изоформами тяжелой цепи миозина, которые они экспрессируют [57]. Различие механических и кинетических характеристик изоформ миозина обеспечивается разницей последовательности аминокислот в каталитическом и конверторном домене, а

также в области рычага между α- и β-тяжелыми цепеями миозина [46].

В миокарде млекопитающих экспрессируется два варианта тяжелых цепей миозина (ТЦМ) – α и β. Известно, что тяжелые цепи миоизина в миокарде млекопитающих обладают значительной гомологией среди разных видов. Например, последовательности α-ТЦМ человека, кролика, хомяка и крысы идентичны примерно на 95 % процентов, а β-ТЦМ разных млекопитающих гомологична на 94 % [8].

Две тяжёлых и четыре лёгких цепи могут образовать пять различных изоформ миозина. Три изоформы миозина образуется в миокарде желудочков

(V1, V2 и V3) и две – в миокарде предсердий (А1 и А2). Изоформы V1 (αα) и V3 (ββ) – это гомодимеры, включающие две α- или β-ТЦМ, соответственно, V2 (αβ) – гетеродимер, включающий одну α- и одну β-тяжелую цепь. В

предсердиях изоформы миозина А1 (αα) и А2 (ββ) являются гомодимерами

[58,59].

Сердечная β-ТЦМ обычно соответствует β-ТЦМ скелетных мышц I

типа. β-ТЦМ преобладает в желудочке крупных животных, включая человека,

вто время как α-ТЦМ является преобладающей в желудочке мелких млекопитающих, например, мышей и крыс [13,46,60].

Считается, что сердечная α-ТЦМ присутствует как в предсердиях, так и

вжелудочках, тогда как сердечная β-ТЦМ у мелких животных присутствует только в желудочках [60], однако некоторые исследования показывают наличие в предсердиях β-ТЦМ до 5%. Показано, что у крыс содержание β-

ТЦМ в левом предсердии увеличивается с возрастом – от 0% на момент рождения крысы до 3,5% в возрасте 21 месяц, при этом в правом предсердии возрастных изменений не наблюдалось – около 1% на протяжении всей жизни

15

[12]. Кардиомиоциты взрослых крыс являются гетерогенными, то есть могут содержать два изомиозина [61].

В миокарде разных отделов сердца существует пять видов лёгких цепей миозина: LC1A и LC2A – существенные и регуляторные цепи предсердного типа, LC1v и LC2v – существенные и регуляторные цепи желудочкового типа

[58]. Лёгкие цепи является представителями семейства EF-hand кальций-

связывающих белков, которое также включает тропонин С и кальмодулин

[58].

Благодаря лёгким цепям изоформы миозина предсердий и желудочков различаются, несмотря на гомологичность тяжёлых цепей. Изоформы сердечного миозина желудочка отличаются составом тяжёлых цепей (α или β),

но имеют одни и те же лёгкие цепи [46], однако, в хронически перегруженных желудочках сердца человека существенная лёгкая цепь желудочков LC1V

может частично заменяться предсердной формой LC1A [58,62]. Такое переключение изоформ, по-видимому, является компенсаторным механизмом сердца, так как способствует повышенной кинетике цикла поперечного моста и, следовательно, регулирует сокращение гипертрофированного сердца [62].

Известно, что механические характеристики актомиозинового комплекса зависят от изоформ сердечного миозина [59]. С использованием метода искусственной подвижной системы (in vitro Motility Assay) показано,

что изоформа желудочков V1 передвигает актин в 2-3 раза быстрее, чем изоформа V3 [46,56,63]. Это объясняется более высокой скоростью циклирования поперечных мостиков изоформы миозина V1 и, как следствие,

более высокой скоростью сокращения кардиомиоцита [46]. Кроме того,

изоформа V1 обладает более высокой актин-активируемой и Ca2+-

активируемой АТФазной активностью, чем изоформа V3 [12,63,64], при этом

K+-EDTA-АТФазная активность изоформ сердечного миозина не различается

[64].

Несмотря на существенную гомологию, сердечные изоформы миозина небольших по размеру млекопитающих в 1,5-2 раза быстрее передвигают

16

актин, чем те же изоформы крупных животных [56]. Изометрическая сила,

развиваемая головками миозина разных изоформ тоже зависит от вида животного: у крупных млекопитающих (например, кроликов и свиней) сила,

для изоформы V3 выше, чем для V1, а у маленьких животных (крысы и мыши)

сила, развиваемая головками миозина не имеет отличий для разных изоформ

[46,56,64].

Экспрессия изоформ сердечного миозина зависит от вида, возраста и гормонального статуса животного [46]. Переключение генов изоформ тяжёлых цепей миозина в сердце может происходить в ответ на тиреоидные гормоны щитовидной железы, гемодинамическую нагрузку или различные патологические раздражители, включая застойную сердечную недостаточность, при этом в миокарде грызунов это происходит быстрее и в большей степени, нежели у человека [13].

В частности, в левом желудочке крыс содержание β-ТЦМ повышается с возрастом, и может достигать 50-70%, в зависимости от региона желудочка.

При этом, наиболее значительное увеличение доли β-ТЦМ у крыс линии

Wistar наблюдается с 2 до 5 месяцев [12].

Известно, что под действием гормона щитовидной железы – трийодтиронина снижается экспрессия гена β-тяжелой цепи миозина в кардиомиоцитах, и, таким образом, доля изоформы V1 увеличивается. При недостатке тиреоидных гормонов доля изоформы V3 увеличивается. Таким образом, трийодтиронин – тиреоидный гормон щитовидной железы – регулирует экспрессию генов изоформ тяжёлых цепей сердечного миозина

[65,66].

Изоформы сердечного миозина играют важную роль в адаптации миокарда к различным патологиям, например происходит значительный сдвиг к изоформе V3 при перегрузке давлением [46]. При хронической сердечной недостаточности происходит сдвиг изоформ миозина в сторону V3, что связано с ухудшением механической функции желудочков [67].

17

Сдвиг в экспрессии изоформ миозина от α-ТЦМ к β-ТЦМ приводит к замедлению сокращения миокарда и увеличению экономии в работе сердца

[67]. Известно, что свободная энергия гидролиза АТФ для изоформы V3 –

гомодимера β-ТЦМ – выше по сравнению с V1, что говорит о повышении механо-энергетической эффективности миокарда [63]. В дополнение можно сказать, что изоформа миозина V3 у кролика обладает большей чувствительностью к кальцию по сравнению с V1 [46].

Изоформы миозина миокарда могут вносить разный вклад в процессы кооперативности и есть данные, что при снижении концентрации белка коэффициент кооперативности Хилла может повышаться. При высоких концентрациях ионов Ca2+ в in vitro Motility Assay коэффициент Хилла,

отражающий процессы кооперативности, значимо не отличается для разных изоформ миозина миокарда. Однако при снижении концентрации миозина коэффициент кооперативности Хилла выше для изоформы V3 по сравнению с

V1 [46].

Кардиомиоциты в разных отделах и регионах миокарда могут различаться механическими характеристиками, это происходит благодаря различиям в соотношении быстрых и медленных изоформ миозина V1 и V3.

То есть, механические и энергетические свойства всего сердца различаются в зависимости от изоформного состава миозина [63]. Различия кинетических свойств α-ТЦМ и β-ТЦМ миозина, в свою очередь, могут быть связаны с разнообразием функциональных потребностей в мышечной ткани предсердий

ижелудочков сердца млекопитающих [60].

1.1.4Фосфорилирование регуляторной легкой цепи миозина

Фосфорилирование является ферментативным, в значительной степени обратимым процессом, включающим добавление фосфатного фрагмента одной из многих возможных киназ, которые нацелены в основном на остатки серина, треонина и тирозина в эукариотических клетках. В сердце

млекопитающих источниками фосфата являются хранилища

18

высокоэнергетического фосфата, преимущественно, аденозинтрифосфата и креатинфосфата [68].

Фосфорилирование белков в миокарде млекопитающих может функционировать как общий регуляторный путь, который опосредует или модулирует ответы миокарда на внешние (например, гормональные) и

внутренние (например, миогенные) физиологические эффекты [23].

Исследование специфических сайтов фосфорилирования и их влияния на миокард выявило жизненно важный характер этой модификации [68].

Фосфопротеинами с предполагаемым регуляторным действием сократимости сердца являются миофибриллярные белки тропонин I и RLC,

фосфоламбан и несколько мембранных белков сарколеммы [23].

Фосфорилирование сердечной RLC связано о следующими киназами:

ZIP-киназа, протеинкиназа С (PKC) и киназа легкой цепи миозина сердца

(cMLCK) [50]. Общий уровень фосфорилирования миозина поддерживается балансом активности ферментов, осуществляющих его фосфорилирование

(киназы) и дефосфорилирование (фосфатаза). Регуляция этого баланса происходит путем изменения активности киназ миозина и фосфорилирования регуляторной легкой цепи (RLC), активности фосфатазы и дефосфорилирования RLC и изменением доступности RLC для этих ферментов [69].

Это приводит к увеличению чувствительности миофиламента к кальцию, что увеличивает скорость развития силы за счет увеличения перехода поперечного мостика в прочно связанное, генерирующее силу состояние, одновременно замедляя скорость его распада. Таким образом,

фосфорилирование увеличивает активность миозиновой АТФазы, приводя к ускорению циклирования поперечных мостиков [62].

В миокарде мыши или крысы RLC существует в трех состояниях:

нефосфорилированное, однократно фосфорилированное по серину-14 (Ser14)

или серину-15 (Ser15) и дважды фосфорилированное по Ser14 и Ser15. Эти сайты в основном фосфорилируются специфичной для сердца киназой лёгкой

19

цепи миозина, и частично с помощью ZIP-киназы [50,52]. В то время как RLC

миозина мыши и крысы обладают двумя сайтами фосфорилирования на Ser14

и Ser15, RLC сердца человека имеет только один сайт фосфорилирования на

Ser15 [50,52], RLC кролика и левого желудочка свиньи – один сайт на Ser14 [70], а RLC предсердий свиньи – один сайт на Ser22 [47]. Есть данные, что уровень фосфорилирования RLC желудочка свиньи составляет 89% сразу после получения белка, и затем падает до 81% в течение 12 часов [53].

Известно, что фосфорилирование RLC миозина сердца непосредственно контролирует движение области RLC и S1-области миозина от толстого филамента в направлении тонкого, способствуя формированию поперечных мостиков и усилению кинетики миозина, в том числе и при низком уровне кальция [50,71–73]. Возможным эффектом фосфорилирования RLC может быть не только движение миозинового мотора для образования поперечных мостиков, но и для их отсоединения [50]. Таким образом, фосфорилирование

RLC является важным модулятором взаимодействия между головкой миозина и тонким филаментом. Повышение уровня фосфорилирования связано с повышением скорости образования поперечных мостиков, увеличением изометрической силы и чувствительности к кальцию, уменьшением крутизны отношения «pCa-сила» и увеличением Ca2+-активируемой и Ca2+-независимой силы, а также с увеличением амплитуды и скорости развития силы во время растяжения, то есть усилением активации растяжения [50,72,74]. Уровень фосфорилирования RLC в сердце во время диастолы предопределяет силу активного напряжения, создаваемую сердцем при последующем сокращении

[23], а повышение уровня фосфорилирования увеличивает выработку энергии in vivo, таким образом усиливая систолическую функцию [74].

Снижение уровня фосфорилирования RLC уменьшает силу сокращения миокарда, увеличивает продолжительность сердечного выброса, и может также модифицировать другие саркомерные белки (например, тропонин I) в

качестве субстратов для киназ и/или фосфатаз [23,52]. Долгосрочный эффект сниженного уровня фосфорилирования RLC на примере мышей включает

20