3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

179

сти превышает энергию тепловых флуктуаций и они способны эффективно перемещаться в градиенте магнитного поля как ферромагнетики. При отключении внешнего магнитного поля такие частицы мгновенно теряют намагниченность. Это явление называется суперпарамагнетизмом. Однако слишком малый размер частиц уменьшает возможность воздействия на них магнитного поля [1320].

Какой размер частиц следует считать оптимальным для доставки лекарственных веществ? Известно, что частицы размером больше 1 – 2 мкм плохо циркулируют в мелких капиллярах и могут вызывать воспалительные процессы [1321]. Кроме того, частицы такого размера могут подвергаться опсонизации и удалению из русла крови с помощью РЭС большей частью в печени (60% – 90%) и селезенке. Для инъекции в кровь идеальный размер частиц не должен превышать 200 нм. Частицы большего размера должны обладать эластичностью для проникновения в мелкие капилляры и движение по ним [413]. Липосомы, в том числе стерически стабилизированные липосомы, размером 50 – 200 нм обладают также повышенной способностью проникновения в капилляры [767,1322-1325] и в опухоли [1326-1329]. Для медицинской визуализации различных процессов, в том числе ЯМРвизуализации магнитных частиц, оптимальный размер может быть менее 100 нм [413,1330].

Наиболее широко используются суперпарамагнитные частицы окиси железа (Fe2O3). Существует следующая классификация магнитных частиц по размерам [1331]:

1). Сверхмалые суперпарамагнитные частицы (USPIO – ultrasmall superparamagnetic particles). Диаметр: < 1 – 40 нм. Благодаря суперпарамаг-

нетизму частицы такого размера не сохраняют остаточной намагниченности после удаления внешнего магнитного поля [1332]. Поэтому они не образуют агрегатов, которые могли бы препятствовать кровотоку. Такие частицы могут циркулировать в крови в течение нескольких часов. Их удаление связано с фильтрацией через почки в мочу. Они также могут захватываться клетками Купфера в печени, попадать в лизосомы, далее попадать в желчь и экскретироваться с калом [1333,1334].

2). Малые суперпарамагнитные частицы (SPIO – small superparamagnetic particles). Диаметр: 50 – 150 нм. Магнитные частицы этого размера удаляются клетками ретикулоэндотелиальной системы [1335] большей частью через печень (60 – 90%) и селезенку (3 – 15%) [ 413].

3). Монокристаллические соединения окиси железа (MION – monocristalline iron oxide compounds). Диаметр: 100 – 200 нм.

Размер частиц оказывает большое влияние на время их циркуляции в крови (Рис.35).

180

Рис.35. Соотношение между временем нахождения в крови и размером магнитных частиц [1284]. Время представлено в условных единицах. График показывает, что при увеличении размеров частиц время их циркуляции в крови уменьшается [1336].

При оценке потенциальной токсичности самих магнитных частиц необходимо учитывать, что этот фактор в значительной степени зависит не только от состава частиц, но и от их размеров, площади поверхности, формы, покрытия и модификации поверхности [1337]. Из простых геометрических расчетов следует, что при уменьшении размеров частиц возрастает соотношение поверхности к объему. Следовательно, в расчете на единицу веса частиц возрастает поверхность, где могут происходить различные химические процессы. Частицы, в состав которых входят металлы переменной валентности, например, железо, могут активировать процессы перекисного окисления, что может служить причиной их токсичности при попадании в кровь, дыхательные пути и легкие, гастроинтестинальный тракт [1338]. Это правило не всегда строго соблюдается. Так, было обнаружено, что в диапазоне размеров 10 – 150 нм токсичность железоникелевых частиц не изменялась, а после покрытия этих частиц олеатом натрия токсичность возрастала при увеличении размера [1339], что, вероятно, объясняется особенностями эндоцитоза частиц клетками. Токсичность может проявляться также опосредованно, например, продукты деградации частиц могут стимулировать секрецию медиаторов воспалительных процессов [1335]. В целом, окись железа (магнетит), входящий

181

в состав многих магнитных частиц, считается слаботоксичным материалом. Частицы магнетита обычно захватываются клетками Купфера, находящимися в печени, и далее разрушаются гемоксигеназой. Железо связывается с белком ферритином, ответственным за хранение железа и его экзоцитоз из клетки, а также белком трансферрином, ответственным за удаление избытка железа через плазматическую мембрану [1340]. Масштабные исследования фармакокинетики и токсичности суперпарамагнитных частиц окиси железа показали, что при введении в кровь животных 1 мг/кг окиси железа, уже через 1 час 82% частиц захватывалось печенью и 6,2% - селезенкой [1341]. Далее, с полупериодом 3 – 4 дня, железо удалялось из этих органов и попадало в гемоглобин крови. Никаких признаков острого или подострого токсического эффекта не наблюдалось даже при увеличении концентрации частиц до 150 мг/кг веса, что существенно превосходит терапевтические дозы. Магнетит не влияет на кровяное давление, скорость сердцебиений, частоту дыхания и рассматривается как препарат, хорошо переносимый сердечно-сосудистой системой [1342]. Его введение в русло крови человека разрешено FDA [1343].

Однако окись железа способна проявлять токсичность в отношении отдельных клеток при эндоцитозе в цитоплазму значительных количеств частиц, что может быть необходимо для ЯМР-мечения клеток, или для манипуляции клетками в магнитном поле. Поэтому частицы желательно покрывать различными материалами, препятствующими их соприкосновению с цитоплазмой [1344].

4.6.2. Применение магнитолипосом в медицине

Термин магнитолипосомы был впервые предложен в 1983 г. в работе Марголиса с соавторами [1345]. Позже были получены и охарактеризованы два основных типа магнитолипосом. Первый, классический тип [1346], представлен магнитными шариками, заполняющими все пространство внутри бислойной везикулы. Этот тип можно охарактеризовать, как шарик магнитного материала, покрытый бислоем липидов (Рис.36, а). В таких липосомах очень велико соотношение магнитного материала к липиду. Окружающие шарик липиды минимизируют токсический эффект при эндоцитозе в клетку больших количеств парамагнитного материала [1347]. Во внутреннем пространстве таких липосом практически нет места для водорастворимых лекарственных веществ. Поэтому такие липосомы могут содержать только молекулы, растворенные в липидном бислое или прикрепленные к поверхности бислоя.

Второй тип магнитолипосом (Рис.36, б) представлен большими моноламеллярными везикулами (100 – 500 нм), содержащими сверхмалые суперпарамагнитные частицы (1 – 10 нм) во внутреннем водном про-

182

странстве липосом. Обычно такие липосомы получают посредством экструзии липида через калиброванные отверстия соответствующего диаметра [1348]. Достоинством таких липосом является возможность заключения гидрофильных веществ в водном внутреннем пространстве везикул, однако их магнитные свойства снижены, как в следствие более низкого количественного соотношения магнитного материала к липиду, так и вследствие меньшего магнитного момента частиц малого диаметра.

Рис.36. Два основных типа магнитолипосом [1349]: классические (а,в) и большие моноламеллярные, полученные посредством экструзии (б,г). Микрофотография классических магнитолипосом (в) получена с помощью трансмиссионной электронной микроскопии – негативное окрашивание уранилацетатом. Хорошо различимы магнитные частицы (черные), окруженные фосфолипидным бислоем. Средний диаметр частиц 14 нм. Микрофотография больших моноламеллярных магнитолипосом (г) получена с помощью криоэлектронной трансмиссионной микроскопии. В состав липосом входят: EPC; DSPE; PEG2000. Внутри липосомы видны многочисленные магнитные частицы диаметром 2 нм. Частицы образуют суспензию в воде (феррофлюид).

4.6.3. Адресация лекарств с помощью магнитолипосом

Использование магнитного поля позволяет концентрировать магнитолипосомы непосредственно в области терапевтического воздействия. Этот процесс занимает многие часы и требует использования стерически стабилизированных липосом, способных циркулировать в крови достаточно длительное время [1350-1352]. В процессе циркуляции в крови маг-

183

нитолипосомы сохраняют целостность, способны адсорбироваться на поверхности клеток и проникать внутрь посредством эндоцитоза, что позволяет доставлять лекарственное вещество в цитоплазму [1353]. Например, с помощью магнитолипосом к местам дефектов кости доставляли рекомбинантный белок морфогенеза костей человека (rhBMP-2 – human bone morphogenetic protein-2), что позволяло стимулировать рост костной ткани в послеоперационный период [1354].

Для дальнейшего увеличения специфичности адресации к поверхности липосом необходимо прикреплять специфические лиганды. Большим достоинством липосом является возможность прикрепления к их поверхности различных функциональных групп [1355-1357]. Если на поверхности магнитолипосом находится специфический лиганд, лекарство может эффективно доставляться к соответствующим клеткам без проявления токсического эффекта на окружающие ткани [1358]. Так, клетки некоторых опухолей имеют на поверхности избыточное количество рецепторов фактора роста эпидермиса (EGFR – epidermal growth factor receptor). Ис-

пользование магнитолипосом с токсином, к поверхности которых прикреплен эпидермальный фактор роста (EGF) позволяет осуществлять адресацию липосом к этим клеткам [1359]. После эндоцитоза липосомы подвергаются нагреву в переменном магнитном поле, что инициирует высвобождение токсина внутри клеток опухоли. Поскольку рецепторов EGRF в клетках опухолей в 5 раз больше, чем в нормальных клетках, теоретически достижима 5-ти кратная степень избирательности. Авторы работы полагают, что избирательность должна существенно повыситься, если использовать липосомы с большим количеством рецепторов.

Классические магнитолипосомы не имеют свободного пространства внутри везикулы (Рис.37 а) и поэтому с их помощью можно транспортировать только гидрофобные лекарства, которые можно интегрировать в гидрофобный бислой липидов. При использовании классических магнитолипосом было предложено гидрофобизовать водорастворимые лекарства путем прикрепления липидов к молекуле лекарственного вещества. Так, молекулу водорастворимого тетрапептида, принадлежащего гормону семейства гастрин/холецистокинин, можно соединить с полярной частью фосфатидилэтаноламина. Полученный аддукт может быть встроен в бислой магнитолипосомы. При этом экспонированный наружу пептид, может связываться с соответствующими рецепторами на поверхности клетокмишеней [1360]. Контролируемое высвобождение лекарства можно достичь, используя рН-мобильную связь с липосомами, которая может разрушаться при снижении рН в результате эндоцитоза частиц и доставки к лизосомам [1361].

184

Рис.37. Различные стратегии достижения специфического и контролируемого высвобождения лекарств с помощью магнитолипосом. Классические магнитолипосомы (а) не содержат пространства для лекарств внутри везикул. Лекарственные вещества могут быть прикреплены к специализированному липидному якорю на поверхности липосомы или интегрированы в липидный бислой. Большие моноламеллярные липосомы (б) могут содержать лекарственные вещества не только на поверхности или в бислое липида, но и во внутреннем пространстве везикулы. Различные факторы, нарушающие целостность бислоя, или прочность прикрепления молекул к поверхности бислоя: изменение температуры, рН, освещение и т.д., могут приводить к высвобождению лекарственных веществ.

Значительно лучшие возможности хранения водорастворимых агентов представляют большие моноламеллярные магнитолипосомы [1349]. Если лекарство находится внутри больших моноламеллярных липосом (Рис.37 б), разогрев магнитных частиц в переменном магнитном поле до температуры плавления липидов позволяет высвобождать водорастворимые вещества из липосом. На этом принципе основано действие термочувствительных магнитолипосом. Действительно, было показано, что липосомы из DPPC (температура плавления Tm = 42°C) высвобождали водорастворимое содержимое (кальцеин) при нагреве в магнитном поле [1362]. В дальнейшем этот принцип был применен для высвобождения веществ in vivo [1363,1364]. Термочувствительные стерически стабилизированные магнитолипосомы, состоящие из смеси DPPC/DPPE/PEG2000 имели фазовый переход при 41° С [1365]. При нагревании до 42° С они высвобождали 85% заключенного в них доксорубицина в течение 10 мин, что создавало условия для доставки этого агента к клеткам опухоли. Кроме того, с помощью термочувствительных магнитолипосом исследовалась возможность адресации ЯМР-контрастных агентов [1366].

185

4.6.4. Иммунолипосомы в магнитотерапии

Большой интерес представляют исследования иммуно-магнитных липосом, в которых сочетаются преимущества адресации липосом с помощью магнитных частиц, позволяющих концентрировать липосомы в определенных участка тела, с возможностями адресации к определенным клеткам, что достигается присутствием антител на поверхности частиц. Для получения таких липосом были разработаны сравнительно простые и эффективные методы, например, метод испарения в обращенной фазе смеси фосфатидилхолина и холестерина, небольшого количества альдегидов с линейной цепочкой и магнитных частиц [1367]. В результате этой процедуры магнитные частицы окружаются бислоем липидов, а цепочки альдегида вклиниваются между молекулами липида, при этом полярные альдегидные группы оказываются экспонированными наружу. К альдегидным группам можно прикреплять различные белковые молекулы, включая антитела.

Магнитные иммунолипосомы можно доставлять в цитоплазму опухолевых клеток, а затем уничтожать эти клетки путем разогрева в переменном магнитном поле до 45°С [1368], что приводит к долговременной регрессии опухоли [1369]. При этом эффективность доставки липосом к клеткам-мишеням может возрастать в десятки раз. Магнитные иммунные липосомы можно использовать также для увеличения эффективности культивирования стволовых клеток [1370]. Для этого магнитолипосомы с антителами к белку CD-105 прикрепляют к поверхности культивируемых стволовых клеток. После этого клетки подвергают мягкому воздействия переменного магнитного поля, что активирует их движение, существенно улучшает пролиферацию и образование новых колоний. Кроме того, способность иммунолипосом специфически связываться с со строго определенным типом клеток позволяет использовать их для последующей сортировки клеток в магнитном поле [1371].

Магнитные иммунолипосомы можно использовать также в аналитических целях. Известно, что присутствие кардиолипина в крови может служить указанием на наличие патологических аутоиммунных процессов. Использование магнитных липосом с антителами против кардиолипина позволяет собирать эти липосомы после проведения соответствующей реакции, что существенно повышает чувствительность метода [1372].

4.6.5. Магнитная гипертермия

В переменном магнитном поле магнитные частицы можно нагревать до температур, приводящих к гибели клеток. Таким образом, можно вызывать разрушение опухолей. Данный подход называется гипертермией.

186

Эффект гипертермии сильно зависит от размера магнитных частиц. Оптимальным является диаметр частиц около 14 нм [1373,1374]. Теплопродукция также зависит от интенсивности и частоты магнитного поля. Нагрев до 41 – 46° С считается умеренной гипертермией. При таком нагреве можно активировать иммунную систему против клеток опухоли. Поэтому данный подход рассматривают как неспецифическую иммунотерапию ра-

ка [1375,1376].

Разрушение клеток и удаление опухоли (термоабляцию) можно наблюдать при нагреве до 46 – 56° С. При этом происходит некроз тканей [1377]. При таких воздействиях очень важно не повредить окружающие ткани. Поэтому необходима очень точная доставка липосом к злокачественным клеткам. Для решения этой задачи липосомы очень удобны, поскольку к их поверхности можно прикреплять различные лиганды, что позволяет увеличить специфичность адресации [1368].

Использование липосом в целях гипертермии позволяет загружать в клетки большое количество магнитного материала и достигать высокой избирательности. В экспериментах на животных применение магнитолипосом для разрушения опухолевых клеток методами гипертермии исследуется во многих лабораториях [1369,1378-1380]. Хотя успешность этих экспериментов варьирует, исследователи убеждены в перспективности данного подхода. Один из наиболее выразительных примеров регрессии опухоли после гипертермической обработки с помощью магнитолипосом представлен в лаборатории Kobayashi [1381] которые продемонстрировали на животных 100% регрессию остеосаркомы после обработки катионными магнитолипосомами и гипертермии при 42° С (см. на сайте: http://www.biomagres.com/content/2/1/3). Уже через 12 дней опухоль уменьшалась в 1000 раз и не проявляла признаков роста до конца эксперимента (3 месяца). Однако в экспериментах на других типах опухолей, проведенных в этой лаборатории, успех был не столь очевиден

[1379,1382].

4.6.6. Магнитолипосомы для ЯМР-визуализации

ЯМР-визуализация является самым современным неинвазивным методом анатомического исследования. ЯМР-контраст определяется спином протона атома водорода в продольном (Т1 релаксация) или поперечном (Т2 релаксация) направлениях относительно ориентации силовых линий магнитного поля. Соответственно различают агенты, создающие Т1 и Т2 контраст. Т1 контрастеры – это парамагнитные вещества, например гадолиний (Gd) или лантан (Ln III). Присутствие Т1 контрастеров в ткани вызывает более светлое окрашивание соответствующих областей [13831385]. Напротив, Т2 контрастеры вызывают более темное окрашивание тканей. К таким контрастерам относится окись железа. В настоящее время

188

катионного липида DSTAP (1,2-distearoyl-3-trymethylammonium propane)

позволяет существенно увеличить загрузку цитоплазмы магнитными частицами. При этом липидная оболочка защищает клетки от токсического действия окиси железа. Кроме того, присутствие положительного заряда на поверхности этих липосом благоприятствует клатрин-зависимому эндоцитозу. Частицы не экзоцитируются и долгое время остаются в эндосомальном компартменте цитоплазмы. Присутствие частиц в клетках можно наблюдать в течение месяца (30 циклов деления), что можно использовать при долговременном наблюдении меченых клеток в организме [1398]. Это существенно превосходит возможности магнитных частиц, покрытых декстраном, которые не удается обнаружить уже после 5 – 7 циклов деле-

ния [1399-1401].

4.6.7. Терагностика

Чрезвычайно широкий диапазон возможного использования магнитных частиц в медицине позволяет развить концепцию терагностики [1349]. В данном термине объединены понятия терапии и диагностики. Терагностика предполагает создание и использование наночастиц, с помощью которых можно одновременно осуществлять терапевтическое воздействие и следить за результатами этого воздействия. Как было показано выше, магнитолипосомы можно не только направленно доставлять к месту терапевтического действия, использовать магнитное поле для осуществления этого действия различными путями (инициация высвобождения лекарств, различные виды термического воздействия), но и следить за этими процессами с помощью ЯМР.