3 курс / Фармакология / Синтез_и_изучение_свойств_новых_материалов_с_противоопухолевой
.pdf111
ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Все растворители, органические и неорганические реагенты, если это не указано отдельно, использовались без дополнительной очистки.
Масс-спектры были получены на спектрометре Bruker micrOTOF с
электрораспылительной ионизацией. Растворитель — смесь MeOH/CH2Cl2, диапазон регистрации m / z = 50–3000. Значения m / z приведены для сигналов c наибольшей интенсивностью.
Элементный анализ (С, H, N) был проведён на анализаторе Euro EA 3028 HT
CHNSO.
Инфракрасные спектры были записаны на спектрометре Shimadzu IRAffinity-1S FT-IR (4000–400 см−1) в таблетках с KBr для твёрдых образцов.
Измерение спектров ЯМР 1H (400 МГц),13C{1H} проводилось на спектрометре
Bruker Avance. Химические сдвиги (в м. д.) определяли относительно сигнала растворителя, форма сигналов с — синглет, д — дублет, т — триплет, дд — дублет дублетов, тд — триплет дублетов, м — мультиплет.
Регистрацию твердотельных спектров ЯМР 13С проводили на спектрометре Bruker
Avance III 400 WB; рабочая частота 100,64 МГц.
Рентгенодифракционные эксперименты были проведены на дифрактометрах
SuperNova, Dual, (CuKα, λ = 1,54184) и Xcalibur, Eos дифрактометр (MoKα, λ = 0,71073)
при 100 К. Кристаллические структуры были решены прямыми методами и уточнены с использованием программы SHELX, встроенной в комплекс OLEX2. Поправки на поглощение были введены в программном комплексе CrysAlisPro эмпирически с помощью сферических гармоник, реализованных в алгоритме шкалирования SCALE3 ABSPACK. Атомы водорода включались в уточнение с фиксированными позиционными и температурными параметрами.
Для проведения рентгенофазового анализа образца на основе GO использовали дифрактометр Rigaku «MiniFlex II».
Спектры КР регистрировали на спектрометре Horiba Jobin-Yvon LabRam HR800;
ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре Nicolet 8700.
112
Морфологию полученных наночастиц на основе GO определяли с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM-7001F. Термическую стабильность образцов исследовали на термогравиметрическом анализаторе NETZSCH TG 209 F1 Libra в интервале температур 30–900 °C в атмосфере азота при скорости нагрева 5 °C·мин−1.
Качественный и количественный анализ образцов GO проводили методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) на термоспектрометре Fisher Scientific ESCAlab 250Xi с использованием монохроматического AlKα-излучения
(энергия фотонов 1486,6 эВ).
Температурные и концентрационные зависимости физико-химических свойств водных растворов исследовали с использованием следующих приборов:
1)установка Anton Paar DSA 5000 для измерения плотности;
2)микровискозиметр Lovis 2000 M Anton Paar (Австрия) для измерения вязкости;
3)автоматический многоволновой рефрактометр Abbemat WR/MW (Австрия) для измерения показателя преломления.
Описание экспериментальных методик, а также метрологические характеристики представлены в работах [118–129].
Изучение растворимости в воде при атмосферном давлении в интервале температур Т = 293,15–318,15 К проводилось методом изотермического насыщения в шейкере-термостате LAUDA ET 20 с частотой встряхивания 80 Гц. Аликвоты жидкой фазы насыщенного раствора, полученные с использованием вакуумной фильтрации,
анализировались на спектрофотометре СФ-2000 (Россия). На Рис. 4.1 представлен УФ-
спектр водного раствора вещества 1.57 (C = 0,055 г∙дм−3) при λ = 200–400 нм и выполнимость закона Бугера — Ламберта — Бера (R2 = 0,989) при λ = 220 нм.
A / a. u.
1.0221 нм
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0 |
|
|
|
|
200 |
250 |
300 |
350 |
400 |
l / нм
Рис. 4.1. УФ-спектр водного раствора вещества 1.57.
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
113
Для определения концентрации вещества 1.57 в насыщенном растворе
использовали уравнение (4.1) (длина оптического пути составляет 1 см): |
|
C = 0,049Ч A220 , |
(4.1) |
где С — объёмная концентрация вещества 1.57 (г∙дм−3), А220 — оптическая плотность раствора при λ = 220 нм.
Состав равновесного кристаллогидрата вещества 1.57 определяли термогравиметрическим методом на термогравиметрическом анализаторе NETZSCH TG 209 F1 Libra в интервале температур 40–600 °C в атмосфере азота и скорости нагрева 5 °C·мин−1.
Реакцию гидролиза вещества 1.57 в D2O изучали при 25 °C, регистрируя спектры ЯМР 1Н реакционной смеси на приборе Bruker Avance III 400 (400,13 МГц) в течение 24
ч в автоматическом режиме, при этом спектры записывались каждые 30 мин.
Для изучения устойчивости вещества 1.57 в кислой среде (pH 3 и 4) 20 мг вещества
1.57 растворяли в 40 мл водных растворов соляной кислоты различной концентрации (C
= 0,001 и 0,0001 М). После окончания реакции и удаления растворителя, продукт сушили на воздухе. Для изучения устойчивости вещества 1.57 в щелочной среде (pH 10) 20 мг вещества 1.57 растворяли в 40 мл водного раствора NaOH (C = 0,0001 М). После окончания реакции и удаления растворителя, продукт сушили на воздухе.
Изучение распределения вещества 1.57 в системе октан-1-ол–H2O проводили c
использованием шейкера-термостате LAUDA ET 20 (частота встряхивания 80 Гц).
Температуру поддерживали с точностью до 0,1 К, время эксперимента составляло 5 ч.
Для проведения эксперимента был приготовлен раствор вещества 1.57 (C = 1 г∙дм−3) в
деионизированной воде (электропроводность 5,5∙10−6 См∙м−1), к которому добавлялся эквивалентный, объем октан-1-ола (25,0 мл). После достижения равновесия отбирали аликвоту водной фазы. Концентрацию вещества 1.57 в водной фазе определяли спектрофотометрическим методом на приборе СФ-2000 по уравнению (4.1).
114
4.1 Синтез производных 1,3,5-триазинов
Синтез (5-((4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-
5-ил)метанола (3.1)
Цианурхлорид (1,5 моль) растворили в 50 мл ацетона. К полученному раствору прикапывали трис(гидроксиметил)аминометан (1,4 моль), растворенный в 15 мл ацетона. При интенсивном перемешивании в реакционную смесь вводили п-
толуолсульфокислоту в каталитическом количестве. Полноту протекания реакции контролировали с использованием ТСХ (подвижная фаза — хлороформ/метанол 9,5/0,5).
Далее реакционную смесь отделяли от осадка фильтрованием и высушивали.
Выход конечного продукта составил 2,07 г (96 мас. %),
бежевые кристаллы, т. пл. 193–195 °C. Спектр ЯМР 1H
(ДМСО-d6), δ, м. д.: 1.49 (уш. с, 9H, 3CH3), 3.93 (с, 4H, 2CH2),
3.78 (д, J = 5,9 Hz, 2H, 2CH). Спектр ЯМР 13C (ДМСО-d6), δ, м.
д.: 172,4 (Cтриазин), 166,9 (Cтриазин), 99,8 (С), 65,8 (CH2), 63,9 (CH2), 59,2 (CH2), 19,9 (CH3). Элементный анализ, найдено (%): C, 37,22; H, 5,10; N,
18,91 (C6H11N5O2). Вычислено (%): C 38,85; H 4,56; N 18,12. Масс-спектр (ESI-), m / z: 307,0366 [M]-, [C10H13Cl2N4O]-. Вычислено [M]-: 307,0443.
Данные |
рентгеноструктурного анализа |
C10H14Cl2N4O3; M =309,02 г/моль, |
a =11,77100 |
(10) Å, b =12,72050 (10) Å, c |
= 18,5584 (2) Å, β =93,5730 |
(10)°, V =2773,40(4) Å3, кристаллическая система моноклинная, пространственная
группа P21/n, температура 100 К, 24051 отражений, Rsigma = 0,0319, R1 = 0,0355, wR2 = 0,09764.
Синтез (5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-2,2-диметил-1,3-
диоксан-5-ил)метанола (1.57)
В 10 мл воды растворяли аминобромэтанол (0,016 моль), Na2CO3 (0,032 моль), NaOH (0,032 моль) и перемешивали в течение 1 ч при 50 °C. Затем реакционную смесь охлаждали и прикапывали к растворенному в 30 мл ацетона (5-((4,6-дихлор-1,3,5-
триазин-2-ил)амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метанолу (0,008 моль). Полученную реакционную массу перешивали 3 ч при комнатной температуре, контролируя протекание реакции методом ТСХ (подвижная фаза — хлороформ/метанол 9,5/0,5). По
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
115
окончании реакции растворитель удаляли при пониженном давлении, осадок сушили в токе воздуха.
Выход конечного продукта составил 1,36 г (56 мас. %),
белые кристаллы. Спектр ЯМР 1H (400 MHz, CDCl3), δ:
6,14 (т, J = 6.4 Hz, 1H, CH), 6,05 (с, 1H, CH), 3,92 (с, 4H,
2CH2), 3,75 (д, J = 5.9 Hz, 2H, 2CH), 2,36 (с, 8H, 4CH2), 1,47
(д, J = 6.0 Hz, 6H, 2CH3). Спектр ЯМР 13C NMR (101 MHz, CDCl3), δ: 176,2 (Cтриазин), 175,5 (Cтриазин), 166,2 (Cтриазин), 98,9 (C), 64,9 (CH2), 64,3 (CH2), 54,7 (CH2), 27,7 (CH2азиридин), 26,9 (CH2 азиридин), 19,4 (CH3). ИК (см−1): 3344,71,
2978,22, 1537,33, 1448,60, 1417,74, 1225,82, 1072,47, 822,68. Масс-спектр (ESI+), m / z: 345,1646 [M+Na]+, [C14H22N6O3Na]+. Вычислено [M+Na]+: 345,1641.
Данные рентгеноструктурного анализа C14H22N6O3; M = 322,37 г/моль, a
=9,077 (2) Å, b = 9,0823 (2) Å, c = 9,8721 (2) Å, α = 79,883(2)°, β = 83,960(2)°, γ =
72,365(2)°, V = 762,38(3) Å3, кристаллическая система триклинная, пространственная группа P-1, температура 99,97, 20067 отражений из них 3083 уникальных, Rsigma = 0,0231, R1 0,0382, wR2 = 0,1013.
4.2 Синтез производных тетразола
Синтез 5-фенилтетразола (3.2)
В50 мл диметилформамида растворяли 3,71 г (0,057 моль) азида натрия и 4,57
г(0,056 моль) хлорида диметиламмония. Затем приливали 5,95 г (0,050 моль)
бензонитрила и 25 мл диметилформамида. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 8 ч при температуре 110–115 °C. Далее смесь охлаждали и отделяли фильтрованием от выпавшего осадка NaCl. После этого фильтрат упаривали на роторном испарителе. К оставшейся массе добавляли небольшое количество воды и смесь подкисляли раствором соляной кислотой (ω =10 %) до рН
2–3. Образовавшийся осадок 5-R-2Н-тетразола отфильтровали, промывали водой и оставляли сушиться на воздухе. Выход конечного продукта составил 5,19 г (64 мас.
%).
116
Спектр ЯМР 1H (400 MHz, DMSO-d6), δ: 6,94–7,89 (м, 4H, Ar). Спектр ЯМР 13C (101 MHz, DMSO-d6), δ: 156,2 (Cтетразол),
127,35 (С6Н5), 128,97 (С6Н5), 130,59 (С6Н5), 135,66 (С6Н5).
Синтез N-замещённых 5-R-тетразолов
Синтез этилового эфира 5-фенил-2H-тетразол-2-илуксусной кислоты (3.3)
К суспензии 10,0 г (0,068 моль) 5-фенилтетразола в 100 мл ацетонитрила при перемешивании прибавляли 9,5 мл (0,068 моль) триэтиламина. Затем к раствору по каплям прибавляли 8,4 г (0,069 моль) этилового эфира хлоруксусной кислоты.
Реакционную массу нагревали до 50 °C и выдерживали 4ч. После чего реакционную смесь охлаждали и отфильтровывали выпавший осадок гидрохлорида триэтиламина.
Фильтрат упаривали в вакууме и остаток растворяли в хлороформе. Раствор в хлороформе промывали 5 %-ным водным раствором гидрокарбоната натрия (3 50
мл) и дистиллированной водой (2 50 мл). После сушки над Na2SO4 хлороформ удаляли в вакууме. После сушки в токе воздуха получали конечный продукт с Rf =
0,81 (подвижная фаза — хлороформ/метанол 9,5/0,5).
Выход конечного продукта составил 10,39 г (65 мас. %).
Бесцветные кристаллы с т. пл. 85–86 °C. 1,22 (т, 3Н, СН3), 4,20 (кв, 2Н, СH2), 5,9 (с, 2Н, N2-CH2), 7.55–7.60 (м, 3Н, С6Н5), 8.09 (м, 2Н, С6Н5). Спектр ЯМР 13C (101 MHz, DMSO-d6), δ:166.4 (С=O), 164.7 (Cтетразол), 130,8 (С6Н5), 129.6 (С6Н5), 126.9 (С6Н5), 126.6 (С6Н5), 62.2 (СН2), 53.7 (СН2), 14.1 (СН3). ИК спектр, ν, см−1: 1754 (C=O),
Спектр ЯМР 1H (400 MHz, DMSO-d6), δ: 2973, 2941 (С–Н), 1452, 1281, 1154, 1076,
1049, 1021, 932 (CN4), 1220 (C-O-C), 732, 695 (C6H5).
Синтез 5-фенил-2H-тетразол-2-илуксусной кислоты (3.4)
К раствору, содержащему 10,0 г (0,043 моль) этилового эфира 5-
фенилтетразол-2-илуксусной кислоты добавляли 125 мл раствора гидроксида натрия в метаноле (C = 3 М). После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в минимальном количестве воды. Водный раствор подкисляли до рН 2–3 соляной кислотой. Затем выпавший осадок отфильтровывали и сушили на фильтре в токе воздуха.
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
117
Выход конечного продукта составил 6,24 г (71 мас. %). Белые кристаллы, т. пл. 182–184 °C. Спектр ЯМР 1H (400 MHz, DMSO-d6), δ: 5,75 (с, 2Н,
N2-CH2), 7,66–7,50 (м, 3Н, С6Н5), 8,15–8,05 (м, 2Н, С6Н5), 13,8 (уш с, 1Н, OH). Спектр ЯМР 13C (101 MHz, DMSO-d6), δ: 168,3 (С=О), 165,1 (Стетразол), 131,5 (С6Н5), 130,2 (С6Н5), 127,6 (С6Н5), 127,2 (С6Н5), 54,5 (СН2). ИК спектр, ν, см−1: 1718 (C=O), 3434,
2675 (колеб. ОН связи), 2999, 2952 (алифат. С-Н связи), 1451, 1254, 1161, 1074, 1045,
1025, 920 (СН4), 726, 687 (C6H5). Найдено, %: С 52,72, H 4,02, N 27,46. С9H8N4O2.
Вычислено, %: С 52,94, H 3,95, N 27,44.
Синтез хлорангидрида 5-фенил-2H-тетразол-2-илуксусной кислоты (3.5)
5,00 г (0,024 моль) размельчённой 5-фенил-2Н-тетразол-2-илуксусной кислоты нагревали в плоскодонной колбе с 5,20 г (0,025 моль) пентахлорида фосфора при постоянном перемешивании на водяной бане при 85 °C до прекращения выделения газа. По окончании реакции полученную смесь заливали кипящим гексаном. Выпавший осадок отфильтровывали и сушили под вакуумом.
Выход конечного продукта составил 3,61 г (68 мас. %). Белые кристаллы. Спектр ЯМР 1H (400 MHz, DMSO-d6), δ: 5,73 (с, 2Н, N2-CH2), 7,68–7,52 (м, 3Н, С6Н5), 8,13–8,07 (м, 2Н, С6Н5). Спектр ЯМР 13C (101 MHz, DMSO-d6), δ: 168,9 (С=О), 165,4 (Стетразол), 131,5 (C6H5), 130,1 (C6H5), 126,9 (C6H5), 127,1 (C6H5), 56,2
(СН2).
118
4.3 Синтез гибридных триазинилтетразолов Синтез (5-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-2,2-диметил-1,3-
диоксан-5-ил)метил 2-(5-фенил-2H-тетразол-2-ил)ацетата (3.6)
К раствору 1,24 ммоль [5-[[4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-
амино]-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил]-метанола (1.57) в 40 мл ацетонитрила добавляли 1,48 ммоль хлорангидрида 5-фенилтетразол-2-илуксусной кислоты и 1,48
ммоль триэтиламина. Реакционную массу перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. По окончании реакции растворитель отгоняли при пониженном давлении. Продукт очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюент — хлороформ/метанол (9,5:0,5). Очищенный продукт сушили на воздухе.
Выход конечного продукта составил 0,34 г (54 мас. %),
бежевый порошок, т. пл. 226–228 °C. Спектр ЯМР 1H
(400 MHz, CDCl3), δ: 8,17 – 8,12 (м, 2H, 2CHAr), 7,48 (дд,
J = 5,1, 1,9 Hz, 3H, 3CHAr), 5,48 (с, 2H, CH2), 5,37 (с, 1H, NH), 4,77 (с, 2H, CH2), 4,11 (д, J = 11,9 Hz, 2H, CH2), 3,88 (д, J = 11,9 Hz, 2H, CH2), 2,31 (с, 8H, 4CH2), 1,45 (с, 3H, CH3), 1,36 (с, 3H, CH3).
Спектр ЯМР 13C (101 MHz, CDCl3), δ: 176,2 (С=О), 166,9 (Стриазин), 165,8 (Стриазин), 164,8 (СN4), 130,8 (C6H5), 129,1 (C6H5), 127,1 (C6H5), 127,0 (C6H5), 99,0 (С), 65,1 (CH2), 63,1 (CH2), 53,4 (CH2), 52,6 (CH2), 27,1 (CH2), 23,8 (CH3), 23,3 (CH3). ESI+-MS, m / z: 509,2373 [M + H]+ (вычислено для C23H28N10O4: 509,2368). ИК (KBr): ν (см−1) 2994,10, 1759,37, 1552,42, 1409,76, 1199,78, 1043,59, 830,44, 694,45.
4.4Изучение стабильности соединений 1.57 и 3.6
В5 мл 1М HCl растворяли 30 мг соединений 1.57 и 3.6. Перемешивали при комнатной температуре 72 ч. Растворитель удаляли в токе воздуха при комнатной температуре.
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
119
2-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-2-
(гидроксиметил)пропан-1,3-диол (3.7)
Выход конечного продукта составил 0,025 г (95 % мас. %),
белые кристаллы, т. пл. 189–191 °C. Спектр ЯМР 1H (400 MHz, DMSO-d6), δ: 4.95 (уш. с, 3Н), 3.69 (с, 6H), 3.67 (с, 6H), 1.63 (с, 8Н).
2-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-3-гидрокси-2-
(гидроксиметил)пропил-2-(5-фенил-2H-тетразол-2-ил)ацетат (3.9)
Выход конечного продукта составил 0,027 г (96
мас. %), белый порошок, т. пл. 211–213 °C. Спектр ЯМР 1H (400 MHz, DMSO-d6), δ: 8,08–7,97 (м, 2H), 7,55 (тд, J = 4,9, 2,2 Hz, 3H), 5,53 (с, 2H), 4,26–3,89 (м, 6H),
3,87–3,72 (м, 5H), 3,67 (с, 6H), 1,81 (с, 8Н).
4.5 Синтез GO
GO был синтезирован из графита посредством реакции окисления по модифицированному методу Хаммерса и Оффемана. Порошок графита (3 г)
диспергировали в концентрированной серной кислоте (200 мл) на ледяной бане при перемешивании в течение 30 мин. Затем медленно добавляли твёрдый KMnO4 (8 г)
при непрерывном перемешивании в течение 45 мин, после чего добавляли NaNO3 (2
г) при перемешивании в течение 2 ч при 5 °C. Затем реакционную смесь перемешивали в течение 90 мин при 96 °C, постепенно добавляя деионизированную воду (200 мл). Дополнительные порции деионизированной воды (350 мл) и 30 %-
ного раствора H2O2 (10 мл) добавляли для завершения окисления и удаления избытка
KMnO4. Осадок GO отделяли фильтрованием и многократно промывали в 5 %-ном растворе HCl и деионизированной воде до достижения нейтрального значения pH.
Осадок сушили при 65 °C в течение 5 ч, далее повторно диспергировали в деионизированной воде при действии ультразвука в течение 1 ч и затем
120
центрифугировали (20 мин при 4000 об/мин). В результате был получен коричневый
осадок GO с выходом 90 мас. % [130,131].
4.6 Синтез конъюгата GO с 2,4,6-тризамещённым-1,3,5-триазином 1.57
Порошок GO (5 г) диспергировали в 200 мл подщелоченной деионизированной воды (pH 9) при действии ультразвука в течение 15 мин. Затем в полученную смесь добавляли раствор соединения 1.57 в воде (5 г, C = 0,0155 М) и
выдерживали реакционную смесь в ультразвуковой бане в течение 45 мин. Осадок
GO-1.57, выделенный из реакционный смеси, промывали хлористым метиленом и далее деионизированной водой. Полученный GO-1.57 сушили при 37 °C в течение
10 ч.
4.7 Изучение биосовместимости
Изучение гемосовместимости Спонтанный гемолиз эритроцитов
Гемолиз эритроцитов изучали путём измерения оптической плотности супернатантов при длине волны λ = 540 нм с использованием спектрофотометра
Hitachi U2900 (Hitachi, Ltd., Токио, Япония) в соответствии с процедурой, описанной в работе [108]. Исследуемая смесь объёмом 1,5 мл была приготовлена из 0,75 мл растворов соединений 1.57, 3.6 и дисперсии GO-1.57 (в пересчёте на загрузку 1.57)
с различными концентрациями и 0,75 мл суспензии эритроцитов в физиологическом растворе. В итоге были получены растворы соединений 1.57, 3.6 и дисперсии GO- 1.57 с конечными концентрациями 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200 мкМ. После приготовления смеси пробирки, содержащие суспензию эритроцитов и изучаемого вещества в различных концентрациях, инкубировали при 37,0 ± 0,2 °C в течение 1 и 3 ч, далее центрифугировали в течение 10 мин при 2500 об/мин. Суспензии эритроцитов с добавлением эквивалентных объёмов дистиллированной воды и
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/