Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 1. ОРГАНІЗАЦІЯ ДОСЛІДЖЕНЬ З ПРОМИСЛОВОЇ БІОТЕХНОЛОГІЇ

Рис.1. Ламінарний бокс

Конструкція ламінарного боксу дозволяє працювати в стерильних умовах з мікроорганізмами в нестерильному приміщенні.

Асептичні умови в ламінарі створюються за рахунок струменя стерильного повітря, забір якого відбувається з приміщення, і який стерилізується, проходячи через бактерицидні фільтри. Ламінарний рух повітря – рух, при якому хвилі повітря рухаються паралельно, обтікаючи перепони рівномірними шарами. Потік повітря, проходячи через ламінар, рухається до дослідника, що дозволяє звільнити внутрішній простір ламінарну від спор мікроорганізмів. Таким чином, посіви мікроорганізмів проводяться в потоці стерильного повітря, що пройшов через бактерицидні фільтри та розподілився всередині ламінарну у вигляді ламінарного потоку (без завихрень). Однак в ламінарі слід працювати біля полум’я спиртівки.

Інша назва ламінарного боксу – установка обезпилювання з горизонтальними або вертикальними потоками повітря (УО-БГ або УО-БВ, Ужгород або КПГ-1М; ШЛВ-1 або ШЛВ -2а-01в, м.Харків, «БіоаАналітичні Технології»).

1.2. Посуд, інструменти та матеріали

Лабораторія повинна бути укомплектована приладами й обладнанням, необхідним для роботи з різними групами мікроорганізмів з урахуванням особливостей їх біології, а також для проведення дослідів і виконання аналізів різних матеріалів (рис.2.).

Рис. 2. Інвентар, необхідний для проведення лабораторних робіт

11

РОЗДІЛ 1. ОРГАНІЗАЦІЯ ДОСЛІДЖЕНЬ З ПРОМИСЛОВОЇ БІОТЕХНОЛОГІЇ

Влабораторії для роботи з мікроорганізмами необхідно мати наступне обладнання:

-петлі та голки бактеріологічні (рис.3);

-шпателі скляні та металеві;

-пінцети, ножиці, скальпелі, шприци;

-ємності з дезінфікуючими розчинами; олівці по склу;

-газові або спиртові пальники;

-самплери (автоматичні піпетки або дозатори);

Рис.3. Бактеріологічні голка (а), гачок (б) та петля (в).

-набір стерильного посуду (чашки Петрі, пробірки, колби, мірні пляшки, піпетки градуйовані, скляні матраци тощо).

–набір фарб і реактивів для фарбування препаратів;

–пристрої для фарбування препаратів;

–скельця предметні та покривні; скельця з лунками;

–штативи для пробірок;

–негігроскопічна вата і марля з метою виготовлення ватно – марлевих пробок, ватних пробок для піпеток й скляних трубок, дезінфекції та стерилізації робочих поверхонь, інструментів, рук, для фільтрування середовищ

–прибори для фільтрування (фільтри Зейтца, бактеріальні фільтри

різної конструкції тощо).

Якщо використовується одноразовий пластиковий мікробіологічний посуд (пробірки, піпетки, чашки Петрі), необхідно мати спеціальне обладнання для його дезінфекції та утилізації.

1.3. Правила роботи в лабораторії промислової біотехнології

Співробітники мікробіологічних лабораторій та студенти на лабораторних заняттях повинні пам’ятати, що вони працюють із культурами мікроорганізмів, які не завжди є нешкідливими для здоров’я людини. Тому, при роботі в лабораторії промислової лабораторії необхідно завжди дотримуватись правил безпеки:

1.До приміщення лабораторії заборонено заходити без спеціального одягу - халату.

2.Забороняється заносити до лабораторії сторонні речі.

3.Робоче місце мікробіолога повинно бути добре освітленим та зручним.

4.Працювати у лабораторії дозволяються лише у спецодязі (халаті) з прибраним волоссям.

5.Не дозволяється виходити за межі лабораторії в халатах або одягати верхній одяг на халат.

6.Двері лабораторії повинні бути постійно зачиненими.

12

РОЗДІЛ 1. ОРГАНІЗАЦІЯ ДОСЛІДЖЕНЬ З ПРОМИСЛОВОЇ БІОТЕХНОЛОГІЇ

7.У приміщенні лабораторії не дозволяється приймати їжу, не допускається зайвих розмов і непотрібних переходів. Працювати бажано сидячи.

8.При використанні біологічного матеріалу не дозволяється ставити посуд, який містить матеріал для дослідження, безпосередньо на стіл. Для цього використовуються підноси або кювети, посуд попередньо протирають ззовні дезінфікуючим розчином.

9.У випадках пошкодження посуду з мікробіологічним матеріалом або його витіканням слід негайно повідомити відповідальну особу і

провести заходи для обеззараження забрудненого одягу, частин тіла, предметів робочого місця.

10.При роботі з мікробіологічним матеріалом необхідно використовувати загальноприйняті технічні прийоми, які виключають можливість контакту рук з мікробіологічним матеріалом.

11.Користуватися лише своїм робочим місцем і прикріпленим до нього обладнанням.

12.Всі посіви мають бути підписані.

13.Під час роботи підтримувати чистоту та порядок. Уникати зайвих рухів руками над відкритими чашками Петрі. Всі реактиви та барвники ставити на свої місця, не класти на столи пробки від пробірок, піпетки, бактеріологічні петлі.

14.Використані піпетки, предметні й покривні скельця, шпателі і т.д. поміщають у дезінфікуючий розчин. Пінцети, бактеріологічні петлі фламбують у полум’ї пальника і ставлять у штатив.

15.Усі використані матеріали (відпрацьовані пробірки з культурами мікроорганізмів, інфіковані матеріали) знешкоджують в автоклаві. Ця робота виконується співробітниками лабораторії.

16.Інструменти, які використовувалися в роботі, та поверхню робочого столу необхідно дезінфікувати.

17.Необхідно також пильно слідкувати за чистотою рук - по закінченні роботи руки дезінфікуються.

18.Після закінчення роботи поставити в термостат засіяні чашки й пробірки. Культури мікроорганізмів і залишки досліджуваного матеріалу необхідно здати викладачеві, а робоче місце привести в порядок і продезінфікувати.

19.Необхідно проводити вологе прибирання і періодичну дезінфекцію всіх робочих приміщень.

1.4. Ведення лабораторного журналу

Журнал лабораторних робіт є документом, що дозволяє контролювати правильність отриманих результатів, їх узагальнювати і аналізувати. Записи роблять ретельно і розбірливим почерком, у певному порядку:

13

РОЗДІЛ 1. ОРГАНІЗАЦІЯ ДОСЛІДЖЕНЬ З ПРОМИСЛОВОЇ БІОТЕХНОЛОГІЇ

1 – дата досліджень;

2 – об’єкт досліджень;

3 – мета досліджень;

4 – умови проведення досліду;

5 – основні методи досліджень і аналізу; 6 – отримані результати (як правило, оформляють у вигляді таблиці, графіка, діаграми);

7 – аналіз отриманих результатів, оформлення висновків.

14

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

Процес стерилізації є одним з найнеобхідніших заходів у практиці промислової біотехнології. Процедурі стерилізації підлягають мікробіологічні середовища, посуд, інструменти, деякі пристрої. Це робиться з метою недопущення розвитку сторонніх мікроорганізмів при роботі з досліджуваними культурами.

Стерилізація (від лат. sterilis – безплідний) – це повне знешкодження матеріалу від вегетативних клітин мікроорганізмів та їх форм спокою (спор, цист та ін.).

Для стерилізації використовують різні методи, які можна поділити на фізичні та хімічні.

Можливість і доцільність застосування того чи іншого способу визначається особливостями матеріалу, що підлягає стерилізації, його фізичними і хімічними властивостями, метою дослідження. Найчастіше в практиці промислової біотехнології застосовується термічна стерилізація.

2.1.Фізичні методи стерилізації 2.1.1. Термічні методи (дії високих температур)

а)прожарюванням в полум'ї пальника

стерилізують безпосередньо перед використанням платинові металеві частини мікробіологічної петлі, дрібні металеві інструменти.

При цьому необхідно пам’ятати, що найвищою є температура у верхній та периферійних частинах полум’я пальника (рис. 4).

Рис. 4. Значення температури

(у 0C) в різних частинах полум’я пальника

б)стерилізація сухим жаром (гарячим повітрям у сушильній шафі). Таким чином стерилізують, в основному, лабораторний посуд, який складають у спеціальні бікси або загортають у папір. Проводиться у спеціальних сухожарових шафах за різних режимів (табл.1).

Перед стерилізацією пробірки і колби закривають корками. Ватномарлеві корки не тільки захищають посуд та його вміст від попадання сторонніх мікроорганізмів, але на відміну від інших (гумових, алюмінієвих, пластмасових), забезпечують повітрообмін із зовнішнім середовищем. При стерилізації скляних піпеток їх верхні кінчики також закривають шматочками вати. При роботі з ними доцільно користуватися

15

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

гумовими грушами, але зручніше використовувати спеціальні автоматичні піпетки з одноразовими змінними наконечниками.

Таблиця 1

Режими стерилізації

Пробірки з корками завертають у папір по 10–15 шт., а чашки Петрі

– по 1–3 шт. Кожну піпетку щільно обгортають папером, а корки на колбах накривають паперовими ковпачками. У такому вигляді посуд розміщують до сушильної шафи і стерилізують. При встановленні на сухожарових шафах температури, слід пам’ятати, що папір та ватно-марлеві пробки обвуглюються при температурі понад 1800 С.

в) стерилізація насиченою парою (вологим жаром) під тиском (автоклавування). Це найбільш надійний та поширений спосіб стерилізації. Проводять за допомогою спеціальних пристроїв – автоклавів (рис. 5), металевих резервуарів, що герметично закриваються і здатні витримувати високий тиск.

Рис. 5. Сучасний електричний автоклав марки НS-61.

Принцип дії автоклава заснований на зростанні температури кипіння води при підвищенні тиску (при тиску в 1 атм температура кипіння води 99,1°С, а при тиску в 2 атм - 119,6°C). При звичайному атмосферному тиску вода закипає при температурі 100°С. При підвищенні тиску на 1 ат (98,0665 кПа) понад звичайного, кип'ятіння і пароутворення починається, коли температура досягає 120-120,5°С. Пара, що утворюється при цих умовах, згубно діє на мікроорганізми протягом 30 хв. Пара при тиску, що перевищує звичайний на 2 атм (196,133 кПа), має температуру 134°С і вбиває мікроорганізми протягом 15-20 хв. Для спостереження за тиском автоклав обладнаний манометром.

В автоклавах стерилізують середовища, а також посуд і інструменти, які можуть бути зруйновані при дії більш високих температур. Більшість живильних середовищ для культивування мікроорганізмів стерилізують протягом 15 хв. при 1 атмосфері на манометрі автоклава, що відповідає

121°С.

16

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

3

1

8

Рис. 6. Автоклави: А – вертикальний; Б – горизонтальний: 1 – стерилізаційна камера; 2 – кран для виходу повітря; 3 – манометр; 4 – запобіжний клапан; 5 – паровий котел; 6 – воронка для заповнення автоклава водою; 7 – водомірна трубка; 8 – кришка автоклава

Автоклави можуть бути різноманітні за формою, розмірами, робочим тиском, конструкцією, але всі вони виконують одну і ту ж функцію – стерилізацію, і принцип їх роботи – практично однаковий. У верхній двостінний металевий резервуар, який герметично закривається, складають матеріал, який підлягає стерилізації (рис.6). Нижній резервуар представляє собою котел, який заповнюється водою. Необхідний рівень води відмічено на спеціальній водомірній трубці автоклава. Верхній та нижній резервуари з’єднані між собою трубкою, по якій піднімається пара при закипанні води у котлі. Пара збирається у верхньому резервуарі і, так як він герметично закритий, в ньому створюється надлишок тиску. Для того, щоб надлишковий тиск не перевищував дозволеної межі, верхній резервуар оснащено спеціальним паровивідним клапаном. Автоклав обов’язково має два манометри, на одному встановлюється необхідний для стерилізації тиск, інший показує поточний тиск у стерилізаційній камері. Як тільки стрілка манометра доходить встановленої позначки, автоматично відкривається паровипускний клапан і надлишок пари виходить із стерилізаційної камери.

В практиці промислової біотехнології стерилізація в автоклаві здійснюється при температурі в межах від 1120 С до 1340 С, тобто від 0,5 до 2,0 атм. Температура нижче 1120 С не є надійною, а вище 1340 С – не є необхідною. Показнику манометра, у фізичних атмосферах, відповідає певна температура (табл. 2).

Температура й тривалість автоклавування визначаються матеріалом, який стерилізується. Живильні середовища, які містять молоко, желатин, пивне сусло, дріжджовий автолізат, вітаміни, цукри стерилізують при 0,5

17

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

атм. протягом 15-30 хв. В основному живильні середовища стерилізуються при 1,0 атм. Але є субстрати, які характеризуються особливою термостабільністю (наприклад, ґрунт). Такі субстрати стерилізують при 2,0 атм. протягом 1-2 год. два дні підряд.

г) Для середовищ, компоненти яких розкладаються при температурі, вищій за 100°С (розчини вітамінів, амінокислот тощо), проводять поетапну дробову стерилізацію, яку можна здійснювати в автоклаві з відкритим паровипускним клапаном (стерилізація текучою парою).

Таблиця 2

Температура насиченої пари при різному тиску

Принцип такої стерилізації полягає в тому, що середовище (чи його компоненти) прогрівається без надлишкового тиску (при 1000 С) декілька раз, а в періоди між прогріваннями дають можливість прорости життєздатним спорам. Обробку текучою парою проводять 3-4 рази протягом 20-40 хв.

Різновидом дрібної стерилізації є тиндалізація. Використовується для середовищ, компоненти яких денатуруються при 600С. Матеріал, який стерилізується, прогрівають на водяних банях та апаратах Коха 5-6 раз, із перервою для переходу спорових форм мікроорганізмів у вегетативні.

д) Одноразове прогрівання матеріалу при температурі нижче 1000С направлене на знищення лише вегетативних клітин мікроорганізмів, називають пастеризацією. Вона, як правило, не забезпечує стерильності. В результаті пастеризації знищується до 90-95% мікрофлори. Ті ж клітини, які залишилися – ослаблені і розмножуються повільніше. Пастеризація широко використовується у харчовій промисловості для обробки продуктів, які швидко втрачають (змінюють) свої смакові і харчові властивості при розвитку в них мікроорганізмів: молоко, ягідні та фруктові соки, вина, пиво та ін. Пастеризацію проводять при 60-750 С протягом 1530 хв. або при 800 С – 10-15 хв. (у деяких випадках матеріал нагрівають до 900 С) із наступним швидким охолодженням до температури нижче 100 С.

є) стерилізація кип'ятінням. Стерилізацію металевих інструментів, предметних скелець, гумових трубок та ін. проводять кип'ятінням. Спори деяких бактерій зберігають життєздатність при кип'ятінні. Рекомендується

18

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

стерилізацію кип'ятінням проводити в 2%-ому розчині карбонату натрію (для пом'якшення води і збільшення температури кипіння) не менше 30 хв. Початком стерилізації вважають момент закипання води у стерилізаторі.

2.1.2. Стерилізація опроміненням та газами

При опроміненні найбільш пригніченими в клітині процесами є окисне фосфорилювання, змінюються фізико-хімічні властивості нуклеопротеїдів, відбуваються зміни в ДНК, порушуються транскрипція, трансляція, функції мембран, пригнічуються енергетичні процеси. Можливі всі види мутацій: геномні - кратні зміни гаплоїдного числа хромосом; хромосомні - структурні або чисельні зміни хромосом; генні або точкові - зміна молекулярної структури генів, в результаті синтезуються білки, що втратили свою біологічну активність.

За допомогою газів стерилізують обладнання та матеріали в тому випадку, коли іншими способами їх простерилізувати неможливо. Найчастіше для цього використовують окис етилену, а також формальдегід. Зважаючи на те, що окис етилену токсичний та вибухонебезпечний, процес стерилізації проводиться висококваліфікованим персоналом у спеціальних камерах та пристосованих для цього приміщеннях. Як стерилізуючі агенти використовують також неіонізуюче (інфрачервоне, ультрафіолетове), іонізуюче випромінювання (β-частки, рентгенівське випромінювання (Х- промені), γ-промені - радіоактивні) та ультразвук.

Опроміненням стерилізують вироби медичного призначення, антибіотики, гормони, вітаміни, перев’язочний матеріал, одноразове пластмасове обладнання. Стерилізацію опроміненням проводять у виробничих умовах.

Опромінення ультрафіолетовими променями використовується, як правило, для обробки повітря в кімнатах, які потребують особливої чистоти, наприклад в ламінарних боксах (бактерицидна дія ультрафіолетового випромінювання – використання бактерицидних ламп). Опромінення ультрафіолетовими променями (260 нанометрів) - найбільш часто використовується в лабораторіях для стерилізації приміщень, настільних боксів. При тривалому впливі ці промені викликають загибель всіх бактерій. Бактерії гинуть дуже швидко, а спори грибів значно повільніше. Тому в боксах встановлюють бактерицидні лампи БУФ-15 або БУФ-30, які включаються на 30 хвилин за 1 годину до роботи. Крім того, рекомендується проводити профілактичне опромінення боксів протягом 2 годин.

2.1.3. Метод фільтрування за допомогою мембранних фільтрів і фільтрів Зейтца

Стерилізація фільтруванням використовується для обробки живильних середовищ та розчинів, компоненти яких не витримують

19

РОЗДІЛ 2. ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНОЇ СТАДІЇ БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ВИРОБНИЦТВ

нагрівання, зокрема, розчини білків, сиворотки, деякі вітаміни, леткі сполуки. Метод полягає у пропусканні (фільтрації) розчинів через дрібнопористі фільтри (табл. 3).

Мікробні клітини затримуються на фільтрах механічно (так як вони більші, ніж діаметр пор фільтру) і шляхом адсорбції клітин на фільтруючому матеріалі. В залежності від матеріалу, із якого виготовлено фільтр, розрізняють мембранні (колоїдні), азбестові, фарфорові, скляні фільтри. Як правило, бактеріальні фільтри пропускають віруси і бактеріофаги.

Таблиця 3

Характеристика мембранних фільтрів “Сінпор”

Фільтрування проводять за допомогою спеціальних приладів (фільтри Зейтца, свіча Шамберлана) (рис. 7). Механізм роботи цих приладів принципово подібний. Верхній отвір стерильної колби покривається мікропористим фільтром, через який пропускається рідина, яку треба простерилізувати. Але пори фільтрів настільки малі, що ця рідина не здатна проходити крізь них самостійно, для цього необхідно створити різницю тисків ззовні колби та в середині. За допомогою спеціального насоса у колбі створюється вакуум і простерилізована рідина збирається у колбі.

1

2

аб

Рис. 7. Фільтри Зейтца із скляним (а) і металевим (б) тримачем та керамічний фільтр (в), з’єднані з колбою Бунзена:

1 – фільтри; 2 – вихід до вакуумного насоса

20