Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 3. ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ФІЗІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ ПРОДУЦЕНТІВ

після висіву його на поживне середовище виросли ізольовані колонії. Існують два основні методи розведення досліджуваного матеріалу:

1)попереднє розведення матеріалу в фізіологічному розчині або в стерильній водопровідній воді в пробірках і висів готового розведення на щільне поживне середовище;

2)на поверхні щільного поживного середовища «методом виснажливого посіву».

Метод Пастера (метод граничних розведень) полягає в тому, що з досліджуваного матеріалу роблять ряд послідовних розведень в рідкому живильному середовищі.

Рис. 10. Приготування серійних розведень (за Тейлор та ін., 2005).

Для цього краплю посівного матеріалу вносять в пробірку зі стерильною рідким середовищем, з неї краплю переносять у наступну пробірку і так засівають до 8 ... 10 пробірок. З кожним розведенням кількість мікробних клітин, що потрапляють в середовище, буде зменшуватися і можна отримати таке розведення, в якому у всій пробірці з середовищем буде знаходитися тільки одна мікробна клітина, з якої утвориться чиста культура мікроорганізму. Так як в рідких середовищах мікроорганізми ростуть дифузно, тобто легко розподіляються по всьому середовищі, то ізолювати одну мікробну клітину від іншої важко. Таким чином, метод Пастера не завжди забезпечує отримання чистої культури. Тому в даний час цей метод використовується, головним чином, для попереднього зменшення концентрації мікроорганізмів в матеріалі перед посівом його в щільне середовище для одержання ізольованих колоній.

2) Методи механічного розділення мікроорганізмів з використанням щільних поживних середовищ. До таких методів відносяться метод Коха (метод глибинного посіву) і метод Дригальского.

41

РОЗДІЛ 3. ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ФІЗІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ ПРОДУЦЕНТІВ

Метод Дригальского заснований на механічному розподілі мікробних клітин на поверхні щільного живильного середовища в чашках Петрі. Кожна мікробна клітина, фіксуючись в певному місці, починає розмножуватися, утворюючи колонію.

Для посіву за методом Дригальского використовують декілька чашок Петрі, залитих щільним поживним середовищем. На поверхню середовища вносять краплю досліджуваного матеріалу.

Потім за допомогою стерильного шпателя цю краплю розподіляють по всьому живильному середовищі (посів газоном). Посів також можна проводити штрихом, використовуючи бактеріологічну петлю (рис.11).

Цим же шпателем або петлею здійснюють посів у другу, третю і т.д. чашки. Як правило, в першій чашці після культивування посіву мікроорганізми ростуть у вигляді суцільного шару, в подальших чашках кількість мікроорганізмів знижується і утворюються ізольовані колонії, з яких відсівом можна легко виділити чисту культуру.

Таким чином, у перших секторах спостерігається суцільний ріст, а уздовж наступних штрихів виростуть відокремлені колонії, що представляють собою потомство однієї клітини.

Хід роботи:

1.Для виділення ізольованих колоній з бактеріальної суміші № 1 зробити посів штрихом у чашку Петрі з м’ясо-пептонним агаром за методом виснаджучих штрихів. Далі чашки поміщають в термостат з температурою 37°С для культивування протягом 1 ... 2 доби.

Посіви розглядають, виділяють ізольовані колонії, що відрізняються за зовнішнім виглядом, описують культуральні властивості виділених чистих культур мікроорганізмів, готують з описаних колоній фіксовані мазки і фарбують їх за Грамом. Далі замальовують мікроскопічну картину

іроблять висновок про якісний склад мікрофлори бактеріальної суміші.

2.Для виділення спороутворюючих бактерій бактеріальну суміш № 2 нагріти на водяній бані до 75 ... 85°С і витримати протягом 20 ... 30 хв. Далі суміш остудити і зробити посів штрихом бактеріологічною петлею на поверхню скошеного м’ясо-пептонного агару в пробірку. Посів культивують протягом 1 ... 2 діб при 37°С.

Посіви досліджують, приготувавши фіксований мазок, пофарбувавши його за методом Грама і провівши мікроскопування для того, щоб переконатися, що накопичувальна культура спороутворюючих бактерій виділена. Замальовують мікроскопічну картину.

3.Для виділення молочнокислих бактерій з сирого молока 0,5 мл молока вносять стерильною піпеткою у пробірку із стерильним знежиреним молоком з додаванням 5% етилового спирту. Далі пробірки

42

РОЗДІЛ 3. ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ФІЗІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ ПРОДУЦЕНТІВ

Рис.11. Посів штрихом, або розведення культури

(за Тейлор Д.та ін.., 2005)

поміщають у термостат з температурою 30°С і проводять культивування протягом доби.

Розглядають і описують характерні особливості згустку, що утворився. Далі готують фіксований препарат, фарбують його фарбою Муромцева. При мікроскопії звертають увагу на зовнішні ознаки вирослих на стерильному молоці з 5% спирту молочнокислих бактерій. Замальовують мікроскопічну картину.

43

РОЗДІЛ 3. ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ФІЗІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ ПРОДУЦЕНТІВ

Контрольні питання:

1. Що розуміють під термінами «чиста культура» (ЧК), «накопичувальна культура», «посів»?

2.На яких прийомах засновані методи виділення ЧК?

3.Чим відрізняються методи виділення ЧК?

4.Які ознаки встановлюють при ідентифікації ЧК?

5.Які поживні середовища рекомендуються для виділення ЧК?

Робота № 7. Способи культивування аеробних та анаеробних мікроорганізмів

Аеробні мікроорганізми

Культивування на поверхні рідкого та щільного поживного середовища. В цьому випадку мікроорганізми отримують кисень безпосередньо з повітря. При поверхневому культивуванні важливо збільшити площу дотику середовища з повітрям. Для цього середовище наливають тонким шаром у посуд із широким дном – чашки Петрі, матраци, скошені поверхні у пробірках, колби. Поверхневе культивування аеробів проводять на щільному або сипучому середовищі, а також у тонкому шарі рідкого середовища в скляному посуді із широким дном: чашках Петрі, колбах Виноградського, матрацах, кюветах.

Засіяні посудини культивують при постійній температурі в термостатах або термостатних кімнатах (термокамерах). Мікроорганізми розвиваються на поверхні середовища й використовують кисень безпосередньо з повітря. На рідких середовищах облігатні аероби ростуть

увигляді рясних плівок. Факультативні аероби (анаероби) розвиваються як

утовщі рідкого середовища, утворюючи суспензії, пластівці, осад, так і на поверхні у вигляді тонкої плівки. На щільних середовищах мікроорганізми ростуть у вигляді окремих колонії або суцільного газону. Поверхневе культивування широко застосовують для одержання накопичувальних і чистих культур, їх зберігання, вивчення морфологічних, культуральних і біохімічних ознак мікроорганізмів.

Упромисловості метод поверхневих культур на рідких середовищах використають для одержання лимонної кислоти, на сипучих - для виробництва ферментних препаратів.

Глибинне культивування у рідкому середовищі. При глибинному культивуванні мікроорганізми використовують кисень, розчинений у воді. Розчинність кисню у воді не досить велика, тому, щоб забезпечити ріст аеробів у товщі рідкого середовища, його необхідно штучно аерувати. Найбільш простий спосіб аерації це струшування колб або пробірок на спеціальних качалках. При цьому відбувається збільшення поверхні дотику живильного середовища з киснем повітря.

Простим і доступним способом періодичного глибинного культивування є вирощування аеробних культур у суспендованому стані в

44

РОЗДІЛ 3. ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ФІЗІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ ПРОДУЦЕНТІВ

рідкому середовищі, розлитому в невеликих обсягах у пробірки або колби різної місткості, які після засівання поміщають на качалки в термокамери. Качалки забезпечують безперервне струшування або обертання посудин з частотою 100-300 об/хв. Ступінь аерації культуральної рідини регулюють зміною частоти обертання (струшування) качалки, обсягом середовища в посудинах і застосуванням спеціальних колб із 4-8 втисненими усередину відросткам - відбійниками для розбризкування рідини. Ефективність насичення середовища киснем при такому методі можна виміряти з певною погрішністю сульфітним методом. Водяний розчин сульфіту, рівний обсягу поживного середовища поміщають у колби, аналогічні колбам, які використовуються для культивування, ставлять на качалки й через певні проміжки часу вимірюють кількість окисленого сульфіту. Вирощування культур у колбах застосовують у лабораторній практиці для вивчення фізіологічних властивостей, установлення закономірностей їх росту залежно від складу компонентів середовища, з'ясування впливу факторів зовнішнього середовища; на життєдіяльність клітин, визначення продуктів метаболізму.

Безперервне глибинне культивування ведуть у лабораторних ферментерах (рис. 12).

Рис. 12. Лабораторний ферментер для глибинного культивування аеробних мікроорганізмів

В промисловості, при вирощуванні мікроорганізмів у ферментерах, досить часто разом із механічним перемішуванням використовують ще й продування через середовище стерильного кисню (рис.13).

Анаеробні мікроорганізми

Вирощування у високому шарі середовища. Рідке середовище наливають до країв пробірок чи колб. Перед використанням середовище прогрівають на водяній бані 30-40 хвилин, і швидко охолоджують, щоб не встиг розчинитись кисень. Посівний матеріал вносять на дно пробірки.

45

РОЗДІЛ 3. ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ФІЗІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ ПРОДУЦЕНТІВ

Рис.13. Схема лабораторної установки для безперервного процесу культивування:

1 – регулятор подавання повітря; 2 – ротаметр (прилад для визначення об'ємної витрати газу або рідини в одиницю часу); 3 – фільтр для повітря; 4 – біореактор; 5- вентиль; 6 – аналізатор вихідного повітря; 7 – фільтр для живильного середовища; 8 ,10

– збирачі живильного середовища та готового продукту; 9 – насос; 10 – закриті пробовідбірники

Пробірки закривають гумовими або скляними пробками. Якщо ріст мікроорганізмів не супроводжується виділенням газів, поверхню середовища заливають стерильним вазеліном або парафіном.

Культивування у в’язкому середовищі. Дифузія кисню у рідину зменшується зі збільшенням її в’язкості. Готують середовище з додаванням 0,5% агар-агару (ущільнювача).

Вирощування у шарі щільного середовища. Посівний матеріал вносять у розплавлене та охолоджене до 45-500С агаризоване середовище. У пробірках поверхню заливають стерильною вазеліновою олією. При використанні чашок Петрі для вирощування анаеробів агаризоване середовище із культурою мікроорганізмів розливають в кришки чашок і, після того як середовище застигне, щільно прижимають до її поверхні дно чашки. Зазор між стінками дна та кришки, де середовище стикається з повітрям, заливають стерильним парафіном (рис.14).

Рис. 14. Культивування анаеробів в чашці Петрі:

1 – агаризоване середовище; 2 – парафін.

Вирощування в анаеростатах. З анаеростатів відкачують повітря, а потім заповнюють сумішшю азоту (80-90%) та вуглекислого газу (1020%), за рахунок якої створюється надлишковий тиск, який перешкоджає проникненню кисню з повітря.

Щодо відношення мікроорганізмів до світла, то більшості мікроорганізмів воно не потрібно, за винятком фототрофних бактерій.

46

РОЗДІЛ 3. ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ФІЗІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ ПРОДУЦЕНТІВ

При посіві анаеробних мікроорганізмів головною метою є одержання середовища без кисню. Для цього:

а) розливають нагріте середовище, заливають його стерильною олією і через олію роблять засів; б) вносять рідке або тверде середовище в пробірку, продувають його

аргоном або азотом із балона, герметично перекривають корком. В середовища можна додавати деякі відновники, що поглинають залишки кисню (наприклад, Fe2+, пірогалол, цистеїн та т.ін.) (рис. 15);

Рис. 15. Культивування анаеробів при поглинанні кисню лужним розчином пірогалолу

в) але найпростіший спосіб – це високий стовпчик, перекритий гумовим корком; г) чашки з анаеробами наливають агаром "під кришки" та вміщують: в анаеростат (ємність, з якої насосом відкачується повітря); вакуумний ексикатор, на дно якого можна помістити хімічні поглиначі кисню (гіпосульфіт Na, пірогалол і т.ін.) (рис. 16);

д) для облігатних анаеробів існує складна техніка культивування в атмосфері інертного газу, з постійною перевіркою на відсутність кисню.

Рис. 16. Металевий мікроанаеростат

Мета роботи. Ознайомитись с основними способами культивування аеробних та анаеробних мікроорганізмів. Освоїти фізичні, хімічні та біологічні методи видалення кисню, ознайомитися з демонстрацією методів культивування анаеробних бактерій.

Матеріали та обладнання:

поживні середовища: МПА і пептонна вода; стерильний посуд (3 пробірки і одна чашка Петрі на студента); бактеріологічні петлі (кожному студенту); штативи; культури мікроорганізмів. Пробірки з анаеробними мікроорганізмами, що виросли в глибині щільного поживного середовища, пробірки з анаеробами, анаеростат, ексикатор з хімічними речовинами, що поглинають кисень (пірогаллол, гідросульфіт натрію), чашки Петрі з щільним поживним середовищем, на якій сумісно вирощені аероби і анаероби, грунт, колби місткістю 250 мл, стерильна вода, піпетки, спиртівки, термостат.

47

РОЗДІЛ 3. ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ФІЗІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ ПРОДУЦЕНТІВ

Хід роботи:

1.Розплавити щільні поживні середовища.

2.Розлити поживні середовища:

-пептонну воду у пробірки;

-МПА у пробірки (стовпчиком та у вигляді скошеної поверхні) та

чашки Петрі. 3.Засіяти:

-штрихом на чашку Петрі з МПА;

-штрихом у пробірку зі скошеним МПА;

-уколом в стовпчик у пробірку з МПА;

-піпеткою у пробірку з пептонною водою.

4.Уважно перегляньте на демонстраційних посівах:

–ріст анаеробів в глибині щільних живильних середовищ

–ріст бактерій у середовищах, що містять редукуючі речовини.

–розвиток анаеробів в анаеростатах.

–ріст анаеробів в ексикаторі з хімічними речовинами, поглинаючими кисень (пірогаллол, гідросульфіт натрію).

–ріст аеробів і анаеробів.

5.Всі демонстраційні посіви замалюйте в альбом.

Контрольні питання:

1.Які умови необхідно забезпечити для нормального вирощування мікроорганізмів?

2.На які групи поділяються мікроорганізми по відношенню до температури?

3.Як забезпечити вирощування аеробних та анаеробних форм мікроорганізмів?

4.Яка техніка посіву на рідкі та щільні поживні середовища?

48