Основные классы ферментов
Класс |
Катализируемая ре-ция |
Тип ре-ции |
Важн. подклассы |
КФ 1 Оксидо-редуктазы |
ОВР. Перенос атомов H и O или е от одного субстрата на др. |
AH + B → A + BH или A + O → AO |
дегидрогеназа, оксидаза, пероксидаза, редуктаза, монооксидаза, диоксигеназа |
КФ 2 Трасферазы |
Перенос функциональной группы от одного субстрата на др. Могут быть метильная, ацильная, фосфатная группа или аминогруппа. |
AB + C → A + CB |
Аминотранс-, фосфотранс-, гликозилтранс-, С1-транс- фераза |
КФ 3 Гидролазы |
Образ. двух продуктов из 1 субстрата в ре-те гидролиза |
AB + H2O → AOH + BH |
Эстер-, гликозил-гидрол-, пептид-, амид-, нукле- аза |
КФ 4 Лиазы (синтезы) |
Негидролитическое добавление или удаление группы к или от субстрата с образование =. Образование C-C, C-N, C-O или C-S связи, присоединение по = |
AB → А + В |
C-O-лиаза, C-S-лиаза, C-N-лиаза, C-C-лиаза |
КФ 5 Изомеразы |
Внутримолекулярная перестановка, то есть изомеризация молекулы субстрата |
AB → BA |
эпимераза, цис-транс-изомераза, внутримолекулярная оксидоредуктаза, и др |
КФ 6 Лигазы (синтетазы) |
Соед. двух молекул в результате синтеза новой C-O, C-S, C-N или C-C связи, сопряжённое с одновременным гидролизом АТФ |
А + В+ ATP → АВ + AТФ + Фн |
C-O-, C-S-, C-N-, C-C-лигаза |
Наиболее важными классами ферментов, применяемых в биосенсорах являются оксидоредуктазы и гидролазы. Их ре-цию проще всего зарегистрировать. В наиболее известных моделях биосенсоров успешно исп. именно ферменты, т. к. в ре-те биохим. ре-ций с ними возникают ионы, электрон, происходит выделение тепла или света и изменяется цвет реакционнной смеси. Это может быть зарегистрировано широким спектром различных преобразователей.
Субстратная специфичность ферментов
Это
спектр
ве-в, ре-ции которых катализируют данный
фермент. Субстратная специфичность
определяет селективность биосенсорного
анализа. Различают абсолютную
и относительную.
Абсолютная-если
фермент катализирует ре-цию 1 ве-ва, а
относительная
катализирует ре-цию нескольких в-в,
близких по строению. Ре-ции с уреазой и
АДГ:
спирт + O2 альдегид + H2O2
Зависимость скорости ферментартивной ре-ции от конц. субстрата
Зависимость скорости ре-ции от конц. определяемого ве-ва лежит в основе град. зависимости каталитического типа. Такая зависимость имеет вид гиперболы (из эксперимента). Для объяснения наблюдаемых экспериментальных зависимостей был предложен механизм, согласно которому в процессе ре-ции активный центр фермента образует с субстратом фермент-субстратный комплекс. Внутримолекулярное превращение этого комплекса приводит к образованию продуктов и регенерации активного центра. Стадии: Р7
Уравнение Михаэлиса-Ментен: (К М) V = (Vmax*[S]) / Кm+ [S] Р8
К М равна конц. субстрата при скорости ферментативной ре-ции равной половине max скорости. К М характеризует сродство данного фермента к тому или иному субстрату. Кинетика ре-ций катализируемых и мобилизованными в биораспознающих элементов сенсоров может отличаться от кинетики ра-ров, часто может наблюдаться увеличение линейного диапазона зависимости скорости ферментативной ре-ции от конц. субстрата. В некоторых случаях градуир. зависимости имеют сигмоидальный характер, а для
их аппоксимации используют сигмоидальное
ур.
Хилла:
Р9
Р7
Р8
Р9
Зависимость скорости ферментативной реакции от pH и t
В пределах физиологических условий зависимость скорости ре-ции от t подчиняется з-нам хим. кинетики (ур. Аррениуса). Выше определённой t начинается тепловая денатурация белковых молекул, которые теряют свою биологическую активность. Р10
Большинство ферментов характерным образом изменяют свою активность в зависимости от pH. Оптимальной активности соответ. определённая область рН, а уменьшение или увеличение рН приводит к снижению активности. Т.О. для работы с ферментными биосенсорами необходимо поддерживать рН с исп. буферного ра-ра.
Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов.
Активаторы-молекулы или ионы, которые увеличивают активность ферментов. Чаще всего в качестве активаторов выступают ионы Ме-Мg, Mn, К и Cl-ион.
Механизмы действия ферментов:
*Ионы явл. коферментами и входят в состав активного центра; *Облегчают образование ES; *Облегчают присоединение кофермента к апоферменту; *Обеспечивает образование устойчивой четверти ной структуры белков.
Ингибиторы-молекулы или ионы, снижающие активность фермента.
По типу хим. связи различают: Обратимые (слабые связи) и Необратимые (ковалентная связь). По механизму действия: Конкурентные и Неконкурентные.
При конкурентом ингибировании структура ингибитора сходна со структурой субстрата, поэтому связывание ингибитора с ферментом происходит в активном центре с образованием комплекса фермент-ингибитора. Когда в реакционной смеси одновременно присутствует и субстрат и ингибитор они конкурируют за один и тот же связывающий центр. При увеличении конц. субстрата происходит вытеснение субстрата из активного центра фермента. Ф имеют ряд преимуществ как основные компоненты биорецепторных элементов биосенсоров: *Ф высокоспецифичны; * Ф катализируют биохим. ре-цию превращения субстрата с высоким числом оборотов, что повышает уровень анализируемого сигнала и увеличивает чувствительность сенсоров; *Ф действуют очень быстро. К недостаткам Ф: *высокую стоимость, которая обусловлена трудностью их выделения и очистки; *иммобилизация ферментов приводит к частичной потере активности; *некоторые ферменты нестабильны и со временем инактивируются.
Целые клетки микроорганизмов
Основы для исп. целых клеток в рецепторных элементах сенсоров, явл. содержащиеся в них наборы ферментов. В результате усвоения микроорганизмами орган. ве-в изменяется их дыхательная активность. Дыханием можно назвать процессы получения хим. энергии за счёт окисления орган. ве-в. Такие процессы: не только внешнее дыхание, для которого нужны специализированные органы, но и дыхание в клетках организма. При внутреннем дыхании энергия запасается организмом виде универсального энергетического носителя-аденазин трифосфата (АТФ). Некоторые кол-ва энергии рассеивается в виде тепла. Все остальные процессы в организме получают энергию от АТФ. Один из главных механизмов синтеза АТФ явл. окислительное фосфорилирование это образование АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Восстановительные эквиваленты НАД и ФАД образуются при окислении органических субстратов. Т.О., аэробные бактерии при окислении субстратов потребляют кислород. Скорость потребления кислорода зависит от конц. субстрата в среде и метаболической активности микроорганизмов. Эти особенности микроорганизмов исп. при создании биосенсоров электро-хим. типа. Р11
Исп. люминесцентных бактерий для создания оптических биосенсоров.
Организмов, способных к биолюминесценцию локализованы светоизлучающие биолог. ферменты-люцеферины. Представляют собой небольшие молекулы, которые являются субстратом для соответствующих ферментов-люцифераз. Люцеферины окис
Р10
Р11
ляются в присутствии люцифераз с образованием окси-люцеферина и излучением света. Люминесцентные бактерии чаще всего встречаются в морской воде.
Интенсивное развитие методов генной инженерии позволило расширить возможности получения люминесцентных микроорганизмов.
Привлекательные св-ва клеток по сравнению с Ф
*Клетки - доступный биологический материал, они культивируются, легко воспроизводятся и поддерживаются в чистой культуре; *В отличие от ферментов клетки не требуют дорогостоящих стадий очистки;
*Клетки сохраняют все наиболее важные структуры и проявляют большую стабильность. В некоторых случаях они обеспечивают жизнеспособность и активность ферментных систем в течение нескольких лет; *В клетках локализовано множество ферментов. Это позволяет проводить сложные последовательные реакции, осуществляя многостадийные процессы; *Для многих типов клеток, особенно микробных, предложены эффективные методы генетических операций, что открывает возможность для работы с высокоэффективными каталитическими системами; *Возможность использования для определ. комплексных показателей загрязнения.
Недостатки: клетки неселективны, низкая чувствительность клеток.