5.ФЕРМЕНТАЦИОННЫЕ ПРОЦЕССЫ

5.1.Получение посевного материала

Технологический процесс получения продуктов микробного синтеза состоит из трех основных стадий: получение посевного материала, поверхностное или глубинное культивирование микроорганизма, получение биопрепаратов из культуральной жидкости или поверхностной культуры.

Посевным материалом называют чистую культуру микроорганизма, полученную путем последовательного постадийного накопления массы культуры продуцента.

Для получения посевного материала используют исходную музейную культуру продуцента, которая поступает в заводскую лабораторию из отраслевого НИИ или с посевной станции. Необходимое количество посевного материала выращивается в отделении чистой культуры (ОЧК) в асептических условиях, гарантирующих отсутствие примесей других микроорганизмов. Чистая культура поступает на предприятие, как правило, в пробирках на скошенных агаризованных средах. Каждая производственная культура сопровождается паспортом, в котором указаны продуцент, его коллекционный номер, дата изготовления, средняя активность серии и срок годности, характеристика среды для выращивания и хранения. Культуру проверяют на микробиологическую чистоту и биохимическую активность.

Хранение исходных штаммов продуцентов – ответственная и сложная задача. При длительном хранении могут возникать спонтанные мутации. Наибольшая возможность проявления спонтанной изменчивости культуры возникает в тех случаях, когда исходным штаммом является мутант. В связи с этим необходимо периодически проводить рассев культуры и проверку по морфологическим и физиологическим признакам. При рассевах отбирают колонии, дающие наилучшие результаты. Такая непрерывная селекция позволяет сохранить в активной форме культуру продуцента. Длительные промежутки между пересевами недопустимы в связи с тем, что микроорганизмы в процессе роста и хранения потребляют из среды питательные вещества и выделяют в нее продукты обмена, вредно влияющие на их свойства.

Исходную культуру хранят чаще всего на агаризованной среде в пробирках при температуре 4–6°С. Более длительное время можно хранить культуру под слоем медицинского вазелинового масла. Слой стерильного масла должен иметь толщину около 1 см.

34

Лиофильно высушенные культуры могут сохраняться до 5 лет без потери способности к быстрому росту и накоплению целевого продукта.

Грибные и дрожжевые культуры успешно хранят в замороженном состоянии в жидком азоте при температуре от –165 до –196°С. Культуру замораживают в 10%-ном водном растворе глицерина в запаянных ампулах, которые содержат в контейнере с жидким азотом. В этих условиях активность культуры полностью сохраняется до 5 лет.

Промышленные культуры актиномицетов хранят в производственных условиях на разваренном стерильном пшене. Выросшую на зерне культуру продуцента высушивают под вакуумом при комнатной температуре до влажности зерна 7–8%. В таком виде культура актиномицетов может храниться несколько месяцев.

Приготовление посевного материала для поверхностного культивирования микроорганизмов. Поверхностный способ при-

меняют в основном при культивировании мицелиальных грибов.

Вэтом случае посевной материал может быть приготовлен в виде:

1)культуры, выращенной на твердой питательной среде;

2)спорового материала;

3)мицелиальной массы продуцента, выращенной на жидкой питательной среде глубинным способом.

Посевную культуру на твердой питательной среде готовят выращиванием микроорганизмов в возрастающем количестве в 3–4 этапа. Состав питательной среды определяется свойствами микроорганизмапродуцента. Чаще всего для этой цели используют увлажненные пшеничные отруби. Влажность среды после стерилизации должна составлять в зависимости от вида продуцента 35–65%. Для рыхлости к отрубям иногда добавляют древесные опилки, солодовые ростки, свекловичный жом.

На первом этапе приготовления посевного материала исходную культуру продуцента пересевают в пробирку с 1,0–1,5 г стерильных отрубей и выращивают при оптимальной температуре до обильного спорообразования.

На втором этапе продуцент культивируют в тех же условиях и на той же среде в колбах емкостью 0,75–1,0 дм3, содержащих 40–100 г влажной среды (из одной пробирки засевают среду в 3–4 колбах).

На третьем этапе (дополнительный этап, при малом спорообразовании у продуцента) культивирование осуществляют в колбах с 300 г влажных отрубей до наступления обильного спорообразования.

На четвертом этапе полученный посевной материал используют для засева посевных кювет. Кюветы прямоугольной формы размером

35

600×400 мм и высотой борта 20–30 мм выполнены из сплошного листа оцинкованного железа, снабжены крышками с одним или двумя отверстиями, которые закрываются ватно-марлевыми подушками. Вместимость посевных кювет 400–500 г воздушно-сухих отрубей. Питательную среду стерилизуют в автоклаве в биксах по 2 кг при давлении 0,15 МПа в течение 1 ч, а посевные кюветы – в стерилизационных шкафах при температуре 120–130°С в течение 2,0–2,5 ч.

Содержимым одной колбы засевают 20 посевных кювет. Посевной материал смешивают с питательной средой в отдельной емкости с соблюдением всех правил асептики и раскладывают в кюветы слоем толщиной 0,8–1,2 см. Между кюветой и крышкой укладывают слой непроклеенной бумаги для предотвращения возможной конденсации влаги на крышке и создания зон излишнего увлажнения растущей культуры. Кюветы со средой помещают на стеллажи в растильные камеры, в которых поступающим через кондиционер воздухом поддерживается определенная влажность и температура. Камеры заполняют кюветами, исходя из удельной нагрузки по культуре 1–2 кг засеянной среды (по сухой массе) на 1 м3 объема камеры. При этом обмен воздуха в камере должен быть равен 2–3 объемам камеры за 1 ч.

Готовый посевной материал снимают с кювет и во влажном состоянии помещают в стерильные пакеты, которые затем хранятся при температуре 3–4°С. Длительность хранения посевного материала не должна превышать 5–6 суток (влажная культура подвержена лизису, и активность ее снижается). При необходимости более длительного хранения посевной материал подсушивают до влажности 10–12% в растильной камере воздухом при температуре 28–30°С, предварительно сняв крышки с кювет. Приготовленный посевной материал представляет собой спороносящую культуру продуцента и должен содержать не менее 0,7 млрд спор в 1 г. Для получения засевной суспензии посевной материал смешивают со стерильной водой в специальной емкости. Суспензия используется для засева среды в производственных условиях.

Споровой материал отличается от спороносящей культуры незначительным содержанием самой питательной среды и состоит главным образом из спор продуцента при небольшом содержании мицелия. Споровой материал содержит 7–10 млрд спор в 1 г. Для получения спорового посевного материала поверхностную культуру подсушивают до влажности 9–10% и подают в вибросепаратор, из которого воздушным потоком (вакуум-насосом) конидии отделяются от среды и собираются в приемник. Споровой материал расфасовывают в поли-

36

этиленовые пакеты в боксе-манипуляторе. Полученный таким образом конидиальный материал может храниться без значительных изменений при температуре 8–24 С до 1,5 лет. За год хранения конидии теряют всхожесть в среднем на 8%.

Споры (конидии) обладают свойством гидрофобности – плохо смачиваются водой. Это приводит к неравномерности засева среды и, следовательно, к неодинаковой скорости роста культуры. Однородную суспензию конидий можно получить добавлением в воду на каждый грамм спорового материала 25–50 см3 ПАВ (алкилбензолсульфата). При этом смачиваемость спор сильно возрастает при неизменной всхожести.

Применение спорового материала облегчает технологический процесс, позволяет более полно механизировать его. Однако получение спорового посевного материала приводит к сильному загрязнению воздуха конидиями. Несмотря на наличие аспирационных устройств, насыщенность воздуха конидиями может достигать 3·102–1·104 на 1 м3, что недопустимо в санитарно-гигиеническом отношении. Это приводит к необходимости применять специальную одежду и индивидуальные средства защиты. Чтобы исключить возможность проникновения посторонней микробиоты, в помещениях цеха чистой культуры поддерживается подпор воздуха (ризб = 0,01–0,02 МПа).

Наиболее безопасным является получение посевного материала глубинным культивированием в виде мицелиальной массы. Отличие этого способа от рассмотренных состоит в том, что культура, выращенная в колбах на отрубях, поступает для засева жидкой питательной среды в лабораторных ферментаторах объемом до 40 дм3. Продолжительность культивирования обычно составляет 24–30 ч. Молодая, активно растущая мицелиальная масса служит посевным материалом для засева производственной среды. Такой способ позволяет в 2,5–3,0 раза сократить длительность приготовления посевного матерала, в 4–5 раз уменьшить площадь отделения чистой культуры, улучшить условия труда, снизить спорообразование в готовой производственной культуре.

Приготовление посевного материала для глубинного культи-

вирования микроорганизмов. При глубинном культивировании микроорганизмов посевной материал готовят также глубинным способом с постадийным увеличением массы культуры-продуцента. В зависимости от мощности предприятия число стадий колеблется от 2 до 5. Общая схема получения посевного материала в асептических производствах представлена на рис. 5.1.

37