Задание 7. Качественная реакция на α-амилазу муки

Ферменты являются специфическими высокомолекулярными белковыми веществами, которые синтезируются в клетках под контролем дизоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) ядер, хлоропластов и митохондрий. Они катализируют все реакции обмена веществ в растениях.

Обмен веществ в растениях разных видов характеризуется протеканием различных ферментативных процессов. Без изучения деятельности ферментов и их специфичности нельзя понять изменчивости химического состава растений.

Активность и специфичность ферментов зависят от различных факторов и, в первую очередь, от концентрации субстрата, активной кислотности среды (рН), температуры и пр. При определении активности ферментов нужно иметь в виду, что каждый фермент характеризуется определенными интервалами величин рН и температуры, при которых он проявляет наибольшую активность и устойчивость. Ферменты весьма чувствительны к воздействию кислот, щелочей, солей тяжелых металлов и к нагреванию.

Для определения ферментов критерием служит специфическая активность, поскольку они часто находятся в клетках в небольшой концентрации и по другим химическим реакциям значительно не отличаются от остальных белков. Основанное на этом принципе определение легко выполнимо, т.к. ферменты сохраняют свою активность при очень большом разведении. Под действием амилаз в растениях происходит гидролиз высокополимерного углерода – крахмала с образованием декстринов и мальтозы. В растениях встречаются α и β-амилазы. Методы определения активности амилазы основаны на учете количества сахара, образовавшегося под действием фермента на крахмал, либо на учете количества нерасщепленного ферментом крахмала, который определяют фотометрически.

Оборудование и реактивы: цитратный буфер, рН 5,6; 2% р-р крахмала, растворимого в воде (2 г крахмала, размешанного в 20 см³ холодной воды, выливают в 80 см³ кипящей воды, после этого нагревают на кипящей бане до просветления раствора); 0,1 н титрованный раствор перманганата, раствор Фелинга, водяная баня с терморегулятором, термостат.

Ход работы. 1. Навеску муки 5 г поместить в коническую колбу на 100 см³.

2. Добавить 50 см³ дистиллированной воды, перемешать и оставить на 30 мин. при комнатной температуре.

3. Отфильтровать содержимое колбы через плотный складчатый фильтр (первые мутные порции фильтрата возвращать на фильтрование).

4. В 4 колбы по 100 см³ внести по 5 см³ вытяжки.

5. Нагреть в течение 15 мин. на водяной бане при температуре 70^оС.

6. Охладить быстро под краном с холодной водой (при этом β-амилаза полностью инактивируется, а α-амилаза продолжает оставаться активной).

7. После охлаждения добавить во все колбы цитратного буфера по 5 см³ рН 5,6.

8. В две контрольные колбы добавить по 20 см³ раствора Фелинга, 10 см³ 2 % раствора крахмала. Наблюдают образование красно-бурого осадка.

9. Две другие колбы нагревают на водяной бане при 40^оС в течение 10 мин, после чего в колбы добавляют по 10 см³ 2 % р-ра крахмала, предварительно нагретого до 40 ^оС. Точно замечают время и выдерживают в водяной бане или термостате при 40^щС в течение 30 мин.

10. Добавить 20 см³ раствора Фелинга и определить количество мальтозы, образовавшейся под действием фермента на крахмал.