8138

121

В опытах, проведенных Н. А. Черных с различными культурами на дерново-подзолистой и черноземной почве, показано, что поступление ТМ в растения определяется в основном активностью их ионов в почвенном растворе, чем концентрацией.

Многие виды растений в значительной степени различаются по способности поглощать ТМ. Высшие растения меньше накапливают ТМ и менее устойчивы к повышенным их концентрациям, чем низшие . Наиболее высокое содержание ртути, кадмия, меди и цинка отмечено в грибах, мхах и лишайниках.

Поглощение ионов из почвы или питательного раствора корневыми системами осуществляется разными путями, от которых зависит вероятность поступления иона непосредственно в цитоплазму клеток и скорость его перемещения по тканям и органам растений.

Иммобилизация ТМ в корневой системе может происходить за счет неметаболического необратимого связывания их ограниченным числом участков, расположенных на поверхности клеточной стенки и вдоль симпласта корней. С одной стороны, необратимое связывание предотвращает передвижение части токсичных ионов по клеткам и тканям растения, с другой – этот процесс способствует установлению концентрационного градиента и позволяет в дальнейшем аккумулировать элемент посредством диффузии.

Вслучае обратимого связывания иона компонентами клеточной стенки путем обменной физико-химической сорбции он может пассивно диффундировать в симпласт при наличии концентрационного градиента, что обеспечивает транспорт иона по растению. Участки, задействованные в обменной адсорбции, не обладают селективностью. Обменно-связанная фракция ионов металла легко вымывается из корневых систем растений при замене питательного раствора на не содержащий данный элемент.

Вслучае повышенных концентраций ТМ в питательной среде указанные механизмы не могут полностью исключить поступление ионов

122

через плазматическую мембрану в цитозоль. Транспорт молекул через мембраны осуществляется разными путями в зависимости от химических свойств элементов и их биологической значимости.

Поступившие в цитоплазму ионы могут связываться там с биомолекулами. В этом случае хелатный комплекс либо выводится из клетки, либо аккумулируется в ней (чаще всего в вакуолях). Аккумуляция токсичных ионов в вакуолях в виде малоподвижных соединений в большей мере характерна для растений, толерантных к ТМ.

Оставшаяся в цитозоле в виде свободных ионов или растворимых комплексов фракция симпластическим или трансклеточным путем перемещается из корня в побег и далее – в листья растений по заряженным участкам ксилемы, либо увлекается с транспирационным потоком воды.

Приведенные выше данные показывают, что не все поглощенные растением ионы активно влияют на его метаболизм. Часть токсичных ионов оказывается прочно связанной с реакционно-способными участками на поверхности клеточной стенки и в апопласте, а проникая через плазмалемму

– с внутриклеточными биомолекулами. Какая доля ионов данного металла окажется в свободном виде, а какая – связанной с органическими молекулами, зависит от нуклеофильности лиганда, pH среды и химических свойств элемента. Стабильность комплексов металлов уменьшается в случае отклонения pH среды от нейтральной реакции: при низких pH в силу конкуренции протона с ионом металла за центры связывания в молекулах, а при высоких – по причине конкуренции гидроксильной группы с лигандом. Важно также учитывать, что многозарядные ионы образуют более прочные комплексы, чем однозарядные, обладающие меньшей плотностью заряда.

Таким образом, концентрация поступившего в растение иона сложным образом зависит от качественного и количественного ионного состава среды. Увеличение или снижение числа поступающих в растение ионов определенного элемента в присутствии других ионов или молекул может

123

обусловить неаддитивный биологический эффект в случае сочетанного действия ТМ.

Соотношение концентраций элемента, находящегося в растении в прочно связанном и подвижном состоянии, обусловливает, очевидно, не только степень влияния данного иона на метаболизм, но также определяет клеточные структуры и связанные с их функцией процессы, подверженные максимальному воздействию со стороны токсиканта. Прочно связанные с биомолекулами ионы металлов могут депонироваться в определенных органах, что ограничивает их транспорт и влияние на жизнедеятельность растения. Этот процесс, относимый к механизмам детоксикации, существенно снижает биологическую эффективность ТМ.

Из приведенных выше рассуждений становится понятно, что для правильного понимания механизма действия на растения ТМ помимо особенностей их поступления в клетки важно знать – с какой скоростью, в какой форме они транспортируются по растению и в каких органах накапливаются.

Первые этапы поглощения корневыми системами ТМ неселективны, неспецифичны и осуществляются посредством физико-химической сорбции, а также за счет необратимого неметаболического связывания активными участками клеточной стенки и апопласта. Последующие этапы связаны с переносом ионов через мембраны растений. Это процессы, управляемые концентрационным и (или) электрохимическим градиентами и включающие, помимо диффузии, работу транспортных систем мембран: переносчиков и ионных каналов.

Результирующий отклик биологической системы на воздействие избыточных концентраций ионов металлов во многом зависит от эффективности их детоксикации в растении. К тому же, выяснение механизмов, принимающих участие в детоксикации ионов металлов, необходимо при фиторемедиации загрязненных территорий. Анализу

124

имеющихся в научной литературе сведений о механизмах детоксикации ионов металлов посвящен следующий раздел диссертационной работы.

Детоксикация ионов металлов при поступлении в растения

У растений существует ряд механизмов, обеспечивающих детоксикацию ионов металлов и устойчивость к индуцируемому ими стрессу. В общем случае эти механизмы можно подразделить на две группы: 1) ограничение поступления металлов в растение и цитозоль; 2) изменения метаболизма клеток, направленные на снижение токсического действия металлов и их выведение из организма растений.

Процессы, отнесенные к первой группе, не могут полностью исключить поступление ионов ТМ в клетку и имеют максимальную эффективность при невысоких концентрациях ТМ в среде, а также в случае непродолжительного воздействия ТМ. Многообразные внутриклеточные механизмы детоксикации и формирования устойчивости к ТМ, наряду с эволюционно консервативными механизмами поддержания целостности генома, обеспечивают устойчивое функционирование растений в условиях стресса, вызванного присутствием в окружающей среде повышенных концентраций ТМ.

Многие внутриклеточные механизмы детоксикации, как и процессы, ограничивающие поступление ТМ в растения, неселективны. Эффективным механизмом детоксикации большинства ионов металлов является связывание их органическими кислотами и тиолами в цитоплазме с последующим выводом образовавшихся комплексов в вакуоль. Некоторые виды растений обладают ограниченной способностью выводить ионы металлов в тонопласт, а потому накапливают металлы в виде малоподвижных соединений непосредственно в цитоплазме. Аккумуляция в вакуолях – наиболее эффективный механизм детоксикации для толерантных к ТМ организмов. Причем устойчивые виды растений преимущественно накапливают токсичные ионы в вакуолях корней и побегов.

125

В зависимости от того, является ли синтез связывающих ТМ соединений индуцируемым или они образуются в клетке конститутивно, можно говорить соответственно о специфичности и неспецифичности процесса детоксикации.

Специфичными в отношении связывания ионов металлов считаются богатые цистеином белки – металлотионеины (МТ), синтезирующиеся в клетках животных организмов и растений в ответ на воздействие ТМ.

Согласно рекомендациям комитета по номенклатуре МТ на III Международном конгрессе по МТ и другим низкомолекулярным и металлсвязывающим белкам, который проходил в 1985 г. в Цюрихе, любой полипептид, сходный по структуре или функциям с МТ млекопитающих, причисляется к группе этих соединений. К настоящему времени известны металлсвязывающие белки многих животных и высших растений, эукариотических микроорганизмов и некоторых представителей мира прокариот, включая цианобактерий. МТ разделяют на три класса с учетом химической структуры молекул.

Первый класс (МТ1) – металлсвязывающие белки позвоночных. В металлсвязывающем домене молекула МТ1 содержит 20 остатков цистеина, расположение которых очень постоянно для этого класса.

Второй класс (МТ2) – полипептиды, сходные по строению с МТ1, но не имеющие столь консервативного положения остатков цистеина. Они распространены у беспозвоночных животных, растений, грибов, цианобактерий и некоторых других прокариот, морских водорослей и дрожжей.

Третий класс (МТ3) – фитохелатины, отличающиеся от прочих металлотионеинов ферментативным способом синтеза; обнаружены у высших растений, грибов, некоторых водорослей и беспозвоночных животных.

Металлсвязывающие белки синтезируются в норме в незначительном количестве. Их содержание в клетке резко возрастает при действии ТМ и

126

снижается в случае уменьшения концентрации ТМ в питательном субстрате. Причем повышенные концентрации ТМ в среде стимулируют не только синтез металлотионеинов, но и связывание этими белками большей части поступивших в клетку ионов металлов. С этой точки зрения можно говорить о специфичности механизма детоксикации ТМ металлотионеинами.

Стимуляция синтеза МТ определенного класса зависит от многих параметров, основными из которых являются свойство ТМ и его концентрация, ионное окружение, видовые особенности растений. Различные ионы металлов стимулируют синтез МТ не в одинаковой мере.

В одних и тех же организмах могут образовываться МТ нескольких классов. В растительном царстве наиболее широко распространены металлотионеины третьего класса (МТ3) – фитохелатины, – обнаруженные почти у всех видов растений, а также некоторых грибов и беспозвоночных животных.

МТ3 – это соединения с общей формулой (g-Глу-Цис)n-Гли, где n максимально равно 11, но чаще изменяется от двух до пяти. По этому признаку МТ3 разделяют на две группы – с низким и высоким молекулярным весом. Аминотерминальная аминокислота в структуре МТ3 может меняться: помимо глицина (фитохелатины или кадистины) это может быть серин (гидроксиметил фитохелатины), b-аланин (гомофитохелатины), а также глутамин и цистеин. Соотношение фитохелатинов и их производных зависит от вида растения, а также от пропорций металлов в почве или питательном растворе.

Во многих работах убедительно показано, что МТ3 участвуют в детоксикации ионов ТМ в растениях, хотя существуют другие гипотезы относительно роли фитохелатинов. Механизм детоксикации ионов ТМ фитохелатинами включает несколько стадий: 1) активацию фитохелатинсинтазы ионом металла; 2) образование комплекса МТ3 с ТМ; 3) перенос комплекса в вакуоль. Любое нарушение хотя бы одной из стадий

127

детоксикации ведет к снижению толерантности организма по отношению к ТМ.

С увеличением степени полимеризации растет степень сродства МТ3 к иону металла, а, следовательно, эффективность детоксикации.

Таким образом, не все ТМ индуцируют активацию синтеза МТ3, при этом лишь немногие из них связываются фитохелатинами. Во-вторых, если элемент индуцирует активацию синтеза фитохелатинов, но сам не связывается ими, то повышение в тканях концентрации МТ3 при воздействии этих агентов еще не означает, что указанный механизм вносит решающий вклад в детоксикацию данного иона. Следует обратить внимание и на то обстоятельство, что синтез МТ проявляет зависимость от ионного состава среды. Поэтому очень важно знать, насколько изменяется эффективность механизма детоксикации посредством МТ3 в случае одновременного действия на растение нескольких ионов металлов.

Выяснение вышеуказанных вопросов важно не только для понимания генетических основ устойчивости растительных организмов к токсичным элементам, но и в практическом плане – в случае применения растений для фиторемедиации территорий, загрязненных ТМ

Проведенные исследования свидетельствует, что именно белки являются тем структурным элементом растения, который обеспечивает связывание и обезвреживание избыточных ионов ТМ, поступающих в клетки растений. Кроме того, вышесказанное позволяет сделать вывод о важной роли в детоксикации ТМ аминокислот, входящих в состав белков, в особенности серосодержащих аминокислот, как наиболее активных при связывании ионов ТМ и переводе их в неопасные для живых организмов формы.

128

4.2. Методы оценки токсичности

Токсичность – основное понятие современной токсикологии. В общей форме можно определить токсичность как свойство (способность) химических веществ, действуя на биологические системы немеханическим путем, вызывать их повреждение или гибель, или, применительно к организму человека, – способность вызывать нарушение работоспособности, заболевание или гибель.

Теоретически не существует веществ, лишенных токсичности. При тех или иных условиях обнаружится биологический объект, реагирующий повреждением, нарушением функций, гибелью на действие вещества в определенных дозах. Токсичность веществ, полностью инертных в отношении биологических объектов, может быть количественно обозначена, как стремящаяся (но не равная) к нулю.

Вещества существенно различаются по токсичности. Чем в меньшем количестве вещество способно вызывать повреждение организма, тем оно токсичнее.

Действие веществ, приводящее к нарушению функций биологических систем, называется токсическим действием. В основе токсического действия лежит взаимодействие вещества с биологическим объектом на молекулярном уровне. Химизм взаимодействия токсиканта и биологического объекта на молекулярном уровне называется механизмом токсического действия.

Следствием токсического действия веществ на биологические системы является развитие токсического процесса.

Основной методический подход, позволяющий сделать вывод о присутствии токсического вещества, – метод биологического теста (биотестирования). Под биотестированием понимают определение токсичности воды или водной вытяжки для какого-либо организма. Биотестирование основано на оценке амплитуды реакции конкретного тест-

129

объекта на присутствие токсиканта. Для биотестирования используются тесты на острую и хроническую токсичность.

Методы биотестирования все чаще используются для определения токсических свойств окружающих нас сред: воздуха, воды, почвы, промышленных отходов, материалов и т. д. Это обусловливается рядом обстоятельств: во-первых, указанные объекты обычно содержат большое количество ингредиентов, токсикологические свойства которых не всегда характеризуются простой суммой свойств каждого из них с учетом количественного состава, определяемого аналитическими методами; вовторых, среда часто загрязнена неустойчивыми продуктами взаимодействия и распада, которые иногда токсичнее исходных веществ; в-третьих, количество присутствующих в окружающей среде загрязнителей значительно превышает число удовлетворительных физико-химических методов анализа, позволяющих контролировать их содержание на уровне ПДК. Помимо этого, биотестирование позволяет получить интегральную токсикологическую характеристику природных сред независимо от состава загрязняющих веществ, поскольку большая часть загрязняющих веществ, в связи с отсутствием оборудования, методик и стандартов, аналитически не определяется, в связи с чем методы биотестирования приобретают все большую популярность и внедряются повсеместно.

Метод биологического теста предусматривает постановку эксперимента, в котором используют чистую культуру тест-организма и изучают его реакцию на добавление токсиканта по изменениям какого либо характерного точно измеряемого показателя, который интегрально отражает нарушения жизненно важных функций.

Индикаторную роль может играть любая функция живого организма, изменяющаяся под влиянием химических воздействий, однако преимущества имеют легко измеряемые функции. В связи с этим, можно выделить 3 направления использования биотестов:

1.Качественные тесты на токсичность среды;

130

2.Количественная характеристика токсического эффекта;

3.Использование биотестов для количественного определения токсикантов.

Основной подход в биотестировании – оценка достоверности различий между опытом (средой, содержащей токсикант) и контролем (чистой водой) по какомулибо показательному биологическому параметру тестируемого объекта.

Результаты опыта выражают как в альтернативном (жизнь\сметрь), так

ив градуированном выражении (в процентах к контролю). Имеется 2 типа тестобъектов:

− индикаторные (с наибольшей чувствительностью к токсиканту);

− представительные (представляют данный конкретный биоценоз). Чувствительность большинства тест-объектов колеблется от нг\л до

мг\л.

Как правило, регистрируют морфологические или функциональные изменения. Для регистрации морфологических изменений применяют визуальные наблюдения, биометрические измерения, гистологические методы, а для регистрации функциональных изменений применяют физиолого-биохимические методы .

Действие любого токсического вещества развертывается в несколько фаз (закон фазности реакции):

−безразличие;

−стимуляция;

−депрессия;

−гибель.

Низкие концентрации вещества могут вызвать стимуляцию, более высокие концентрации вызывают торможение ответных реакций, и, наконец, высокие концентрации вызывают гибель организма.

Выделяют ряд критериев, которым должен отвечать метод биотестирования: