8138

141

Примечание: Маленькие черви – черви размером крупнее 1-1,5 см, розового или красноватого цвета. Мелкие черви – свежевылупившиеся черви, почти белого цвета.

В результате эксперимента выявлено, что черви в тестировавшихся субстратах не гибнут, острый токсический эффект отсутствует (исключение – 1 повторность 1-го варианта (с необработанным осадком)). Отмечено, что первыми и больше червей вывелось в варианте с обработанным осадком. Это свидетельствует о приемлемых условиях для жизнедеятельности червей в субстратах с использованием обработанных ОСВ. В субстратах с необработанными также появились мелкие черви, но в меньшем количестве.

4.3.3. Оценка генотоксичности на теплокровных (мышах)

Многие из химических веществ, в том числе ТМ, попадая в организм через пищевые цепи, оказывают не только общее токсическое действие, но и вызывают специфические нарушения генетического аппарата клеток, даже в чрезвычайно малых дозах. Под действием этих агентов, прямо или косвенно, в геноме происходят структурные изменения (мутации), которые могут оказывать влияние на все стороны жизнедеятельности человека.

Поскольку предлагается использовать обработанный осадок в качестве почвоулучшающей добавки и, возможно, удобрения при выращивании

142

растительных культур, употребляемых в пищу, если не человеком, то животными, возникает необходимость исследования возможного генотоксического действия этих культур. Для контроля содержания генотоксических агентов в компонентах среды обитания, и в том числе в пищевых продуктах, кормах и воде используются разнообразные специфические методы, тест-системы.

Одним из способов оценки цитогенетических повреждений служит широко распространенный в последние годы метод подсчета клеток с микроядрами (МЯ). Известно, что МЯ образуются из ацентрических фрагментов хромосом, не попавших в дочерние ядра при переходе клеток во второй клеточный цикл или в результате потери целых хромосом. МЯ-тест имеет ряд преимуществ, позволяя получить сведения о мутагенном действии химических соединений в течение всего клеточного цикла. Другое преимущество МЯ-теста – четкость и простота.

Наибольшее распространение в качестве тест-системы для оценки генотоксического действия различных агентов физического и химического происхождения получил микроядерный (МЯ) тест на полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга мышей in vivo. Благодаря высокой чувствительности, экономичности, возможности проведения оценки генотоксического действия агентов in vivo и стандартизации условий эта тест-система получила широкое применение в научных исследованиях и для решения практических вопросов контроля генетической безопасности. Метод принят Всемирной Организацией Здравоохранения в качестве одной из тестсистем при оценке действия мутагенных факторов окружающей среды на наследственность человека.

В костном мозге ПХЭ являются наиболее удобной популяцией клеток для подсчета частоты МЯ. Они представляют собой предпоследний этап в процессе эритропоэза и, одновременно, конечный продукт серии делений бластовых клеток. Тем не менее, ПХЭ не делятся и, следовательно, сами по себе, как клеточная популяция, не представляют мишени для действия

143

мутагенов. Они, скорее, являются подходящими для определения общего хромосомного повреждения в их предшественниках – эритропоэтических бластовых клетках. Образование МЯ в ПХЭ костного мозга мышей показано на рисунке 20.

Эритробласты

S-фаза

Последнее деление перед выталкиванием ядра

12 часов

Выталкивание ядра

Полихроматофильные

эритроциты

24 часа

Нормохроматофильные

эритроциты

Рисунок 20. – Стадии эритропоэза мышей и образование микроядра

В опытах использовались самцы мышей линии SНK, которых содержали в стандартных условиях и кормили по стандартной диете. На каждый вариант – 5 мышей.

Исследовалось действие сока растений гороха и суспензии необработанного и обработанного осадков на клетки костного мозга мышей in vivo. Растения гороха выращивали в оранжерее на стеллаже в трех вариантах: 1 – исходная почва-контроль; 2 – почва + необработанный осадок; 3 – почва + обработанный осадок. Раз в день мышам вводили 0,1 мл сока в течение 5-ти дней. Осадки измельчали в фарфоровой ступке и просеивали через сито. Вводили их животным per. os в виде водного раствора с 0,14 г/мл осадков по 0,1 мл в течение 5 дней. Работа проводилась в группе

144

цитогенетической безопасности лаборатории радиационной экологии ИТЭБ РАН по стандартной методике.

Подсчет МЯ в ПХЭ осуществляли при помощи светового микроскопа (CarlZeiss, Jena, ГДР), с иммерсионным объективом х100. От каждой мыши анализировались в среднем 3000 клеток. В таблице 18 представлены данные, полученные при введении животным экстракта гороха, выращенного на обработанных и необработанных ОСВ.

Таблица 18

ПХЭ с микроядрами в костном мозге мышей при введении сока гороха

Варианты по условиям роста гороха: I – почва (контроль); II – почва + необработанный осадок; III – почва + обработанный осадок.

По полученным результатам количество ПХЭ с микроядрами в костном мозге мышей групп II и III незначительно отличалось (на 15%), но было в 1,5-2 раза выше, чем в контрольной группе.

В таблице 19 представлены экспериментальные результаты, полученные при изучении генотоксического действия необработанных и обработанных осадков очистных сооружений.

145

Таблица 19

ПХЭ с микроядрами в костном мозге мышей при введении мышам осадков, обработанных и не обработанных реагентами

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что генотоксическое действие обработанного аминокислотами осадка не выявлено при его введении per. os животным in vivo, в то время, как необработанный осадок вызывает в два раза больше цитогенетических повреждений.

4.4. Тестирование на растениях

4.4.1. Методики тестирования на растениях

Для тестирования использованы овощные культуры, поскольку они способны накапливать большие количества ТМ и наиболее уязвимы для возможного загрязнения.

146

Опыты проводились в оранжерее, растения опытов 1 и 3 росли на стеллажах со слоем почвы 0,2 м. Использовалась серая лесная среднесуглинистая пахотная почва.

Опыт № 1. Варианты: I – почва (контроль); II – почва + необработанный осадок; III – почва + обработанный осадок. Площадь каждого 3,5 м2. Доза внесения 60 т/га. Выращивались томаты, горох сорта «Альфа», салат и редис.

Опыт № 2. Были использованы ящики размером 40х60х20 см. Растения высаживались в смесь отмытого песка с ОСВ, без контроля, в вариантах: I - песок + осадок обработанный; II - песок + необработанный осадок; III - песок + необработанный осадок с выравниванием рН до уровня 1-го варианта при использовании NaOH. Доза внесения из расчета 160 т/га. Выращивали горох (30 шт./вариант) и салат листовой Московский (10 шт./вариант).

Опыт № 3. Проводился в вариантах: I – почва (контроль); II – почва + необработанный осадок; III – почва + обработанный осадок. Площадь каждого 2,1 м2. Осадки вносились в два этапа из расчета 71,4 т/га и 47,6 т/га. На первом этапе высажены горох (40 шт./вариант), салат листовой Московский и шпинат, на втором – томаты.

Опыты с растениями салатной горчицы На этих растениях определяли эффективность фотосинтеза (по

поглощению СО2). Измерения проводились в герметичной микрокамере объемом 31 л по замкнутой системе (Лонг, Холлгрен, 1989). Условия: температура +24±1,5оС, отн. влажность 75±5 %, энергетическая освещенность 450 мкмоль м-2/с (около 100 Вт/м2). При измерении в микрокамеру подаются порции СО2 и регистрируется уменьшение концентрации по мере поглощения растениями. Растения выращивали в условиях трех опытов в сосудах (0,5 дм3).

Опыт № 1. Осадки смешивались с отмытым песком. Варианты: I – песок (контроль); II – песок+необработанный осадок; III – песок+обработанный осадок. Доза из расчета 480 т/га (70 г/сосуд).

147

Опыт № 2 и 3. Осадки смешивались с серой лесной среднесуглинистой пахотной почвой. Варианты: I – почва (контроль); II – почва + необработанный осадок; III – почва + обработанный осадок. 6 сосудов на вариант по одному растению в каждом. Доза внесения в опыте №2 из расчета 480 т/га (70 г/сосуд) и опыте №3 – 120 т/га (17,5 г/сосуд).

Концентрации ТМ в почве и ОСВ, а также в растениях определяли атомно-абсорбционным методом в лаборатории АНО «ТЕСТ – ПУЩИНО».

Пробы растений отбирались в зависимости от сроков вегетации (корнеплоды, листья, плоды). Содержание ТМ определялось в высушенных растениях или в свежих с определением влажности. Сушка проводилась в сушильном шкафу при температуре 80оС - 4 часа и 95оС до установления постоянной массы (1 – 2 часа) (Радов и др., 1971).

При наблюдении за ростом и развитием растений замерялась высота растений либо длина листа, при уборке растений их взвешивали и определяли влажность. Рассчитывалось отношение «побег/корень» для выявления воздействия необработанных и обработанных осадков на перераспределение биомассы некоторых культур (салат, томаты).

Были рассчитаны коэффициенты биологического поглощения ТМ, определяемые из отношения концентраций ТМ растение/субстрат, что позволяет оценить интенсивность аккумуляции ТМ растениями из сред разной степени загрязнения (Ковалевский, 1991).

Определение количества хлорофилла в листьях растений проводилось по методике, изложенной Arnon I. D. (1949). Для экстрагирования использовались мелко измельченные навески листьев растений 50 и 100 мг, которые заливались 5 миллилитрами 80 %-ного раствора ацетона. Образцы выдерживались в темном помещении. Определение проводилось на спектрофотометре Hitachi 557.

148

Поглощение растениями тяжелых металлов

Опыт 1

Результаты определения ТМ в растениях представлены в таблице 20.

Таблица 20

Исследования содержания ТМ в растениях первого опыта

149

В варианте с обработанным осадком, плоды томатов и гороха, листья салата, томатов и редиса содержали большинство ТМ в концентрациях меньших, чем растения варианта с необработанными осадками (таблица 20). Исключение составили зеленая масса гороха и корнеплоды редиса, что связано со спецификой накопления в них ТМ.

Коэффициенты биологического поглощения. Исходное загрязнение осадка, который был обработан, оказалось выше, чем осадка, внесенного необработанным. Тем не менее, поглощение большинства ТМ растениями в варианте с обработанным по сравнению с другими вариантами меньше либо равное (листья и плоды томатов, зерна гороха, листья салата 1-го отбора проб, листья и корнеплоды редиса также 1-го отбора).

Сравнение максимальных и минимальных концентраций ТМ

С целью наглядности сравнения результатов по распределению ТМ в растениях по вариантам составлены таблицы сравнения по наибольшим и наименьшим концентрациям (таблицы 21 и 22).

150

Таблица 21

Распределение минимальных концентраций металлов

*- концентрации равны или в пределах ошибки.

В растениях варианта с необработанными осадками практически не содержится ТМ в меньших концентрациях по сравнению с двумя другими вариантами (таблицы 21 и 22), при этом именно в растениях этого варианта большинство элементов находятся в максимальных концентрациях, исключение - зеленая масса гороха и результаты по корнеплодам редиса). В растениях варианта с обработанным осадком, максимальные концентрации достигались по отдельным элементам, в первую очередь – кадмий и хром (исключение – корнеплоды редиса и зеленая масса гороха, где произошло накопление ТМ).

Примечательно, что накопление ТМ в плодах томатов и зернах гороха по сравнению с их зеленой массой значительно ниже, что указывает на наличие в растениях физиологического барьера, не допускающего накопления высоких концентраций ТМ в репродуктивных органах. Эти данные в полной мере согласуются с результатами многих исследований (Каббата-Пендиас, Пендиас, 1989, Алексеев, 1989).