15 Автореферат Смолянова-2

используют крупные пулы плазмы крови доноров, состоящие из более чем 500 образцов, в связи с чем индивидуальные различия усредняются.

При анализе корреляции между сравниваемыми методами с использованием пулов плазмы (смесь 10 индивидуальных образцов с одинаковым титром ВНА, определенным в РВН) было установлено, что коэффициенты корреляции для методов РВН и ИФА с использованием тест-систем с наиболее высоким уровнем корреляции в индивидуальных образцах ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ составляли 0,91 и 0,95 соответственно.

Такие уровни корреляции свидетельствуют о возможности использования метода ИФА с указанными тест-системами взамен реакции РВН для количественной оценки содержания антител.

Таким образом, была показана возможность замены метода РВН на более удобный в рутинной практике метод ИФА для определения содержания вируснейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в образцах плазмы и ЛП ИГЧ против COVID-19.

Глава 4. Разработка методики количественного определения антител к SARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции (плазме крови человека)

Следующей задачей исследования являлась разработка методики, позволяющей количественно определять уровень антител к SARS-CoV-2 в образцах плазмы с целью отбора сырья, а также в фармацевтической субстанции для производства ЛП ИГЧ против COVID-19 с использованием коммерческих ИФА тест-систем. При этом было необходимо разработать стандартный образец предприятия для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в плазме крови человека.

4.1. Разработка первичного стандартного образца для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции

На данном этапе работ был разработан первичный стандартный образец предприятия для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции (СОП-ФС-1), представляющий собой котловую загрузку из объединенных образцов плазмы крови человека, содержащих антитела к SARS-CoV-2. При разработке СОП-ФС-1 были учтены рекомендации ВОЗ, в соответствии с которыми разрабатываемый стандартный образец должен быть идентичным по свойствам, составу и происхождению исследуемым образцам.

Для удобства хранения и применения, а также для обеспечения стабильности физикохимических и биологических свойств СОП-ФС-1 была разработана лиофилизированная форма стандартного образца, включающая следующие стадии получения: внесение в препарат раствора сахарозы до конечной концентрации 2 %; стерильный розлив в асептических условиях по 0,1 мл; лиофильное высушивание; герметизация флаконов. При оценке качества разработанного СОП- ФС-1 было установлено, что он полностью соответствует ФС.3.3.2.0001.19 «Плазма человека для фракционирования», а также показателям качества лиофилизированных форм.

Определение количества антител к SARS-CoV-2 в полученном СОП-ФС-1 проводили с использованием референтного метода – РВН. Титр вируснейтрализующих антител (ВНА) в РВН составил 1/20, соответственно образцу была присвоена активность 20 AKE/мл (антиковидных единиц). За 1 единицу АКЕ образца была принята величина, обратная его разведению, обладающему способностью ингибировать появление на монослое культуры клеток Vero цитопатогенного действия SARS-CoV-2 в двух из трех лунок в реакции нейтрализации против 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2. Таким образом, был введен количественный показатель вируснейтрализующей активности, определенный методом ИФА – антиковидная единица (АКЕ). Полученный СОП-ФС-1 с охарактеризованным количественно показателем специфической

- 11 -

активности позволил модифицировать тест-системы ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ в количественные методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2 с целью дальнейшего использования данных количественных методик для определения специфической активности в плазме для фракционирования, являющейся фармацевтической субстанцией для производства ЛП ИГЧ против COVID-19, а также во вторичных стандартных образцах.

4.2. Валидация методики количественного определения антител к SARS-СоV-2 в фармацевтической субстанции методом ИФА с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ

На следующем этапе исследований была проведена валидация методики количественного определения антител к SARS-СоV-2 методом ИФА с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ в соответствии с ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» по следующим параметрам: аналитическая специфичность, аналитическая область, прецизионность (повторяемость (сходимость) и промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность), линейность, параллелизм. Работы проводились двумя операторами в течение двух дней с использованием разработанного СОП-ФС-1, а также трех серий фармацевтической субстанции (пула плазмы человека для фракционирования, содержащей антитела к SARS-СоV-2). Для полученных значений уровней специфических антител (АКЕ/мл) были рассчитаны величины: среднее значение, стандартное (S.D.) и относительное стандартное (RSD, %) отклонения в соответствии с ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента».

Оценка аналитической специфичности была проведена производителями коммерческих тест-систем, использованных в работе, по результатам испытаний образцов сыворотки (плазмы) крови пациентов, имевших в анамнезе другие типы коронавируса, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, Adenovirus, Human Metapneumovirus (hMPV), Parainfluenza virus 1-4, Influenza A, Influenza B, Enterovirus 71, Respiratory syncytial virus, Rhinovirus, Chlamydia pneumoniae , Streptococcus pneumonia, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, EBV. По данным производителей тест-систем, ни одна из испытанных проб не показала наличие перекрестной реактивности.

Была определена аналитическая область калибровочной кривой, в пределах которой были рассчитаны отклонения полученных значений концентраций всех калибровочных стандартов от номинальных значений и коэффициенты корреляции при определении линейности калибровочной кривой. Также была проведена оценка прецизионности внутри цикла и между циклами, которую определяли как повторяемость (сходимость) результатов и внутрилабораторную (промежуточную) прецизионность (Табл. 2).

Таким образом, было установлено, что результаты, полученные двумя исполнителями, сопоставимы и соответствуют критериям приемлемости.

Линейность и параллелизм при разведении образцов были изучены с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ и серии не менее пяти последовательных разведений разработанного СОП-ФС-1, а также трех серий фармацевтической субстанции (пула плазмы человека для фракционирования, содержащей антитела к SARS-СоV-2), в соответствии с инструкцией по применению компьютерной программы «Паралайн», разработанной в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича (Рис. 1).

В результате было установлено, что зависимости логарифмов оптических плотностей от логарифма кратности разведения для исследуемых ЛП и СОП-ФС-1 линейны и эти линии параллельны друг другу, что соответствует критерию приемлемости. Аналогичные результаты были получены при использовании набора реагентов ИФА ЕИ.

- 12 -

В результате проведенной валидации было установлено, что метод ИФА с использованием двух наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ можно применять при количественном определении антител к SARS-СоV-2 в фармацевтической субстанции, которая представляет из себя пул из более чем 500 индивидуальных образцов плазмы.

Таблица 2 – Основные валидационные характеристики методики количественного определения антител к SARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции методом ИФА

4.3. Изучение стабильности стандартного образца и установление срока годности

Исследование стабильности СОП-ФС-1 охватывало краткосрочную стабильность в течение 6 ч при комнатной температуре (18-25 оС), долгосрочную стабильность при температуре –35 °С в течение 60 дней, а также стабильность после трех циклов замораживания при –35 °С на 12 ч и последующего оттаивания. Согласно полученным результатам, среднее значение

- 13 -

специфической активности СОП-ФС-1 отклонялось от номинального значения не более чем на 20 %, что соответствует критерию приемлемости и подтверждает стабильность СОП-ФС-1 в вышеперечисленных условиях хранения.

4.4.Гармонизация значения специфической активности СОП-ФС-1, выраженного в АКЕ/мл, со значениями референс-панели ВОЗ, охарактеризованной в единицах связывания BAU/мл

На следующем этапе работ была проведена аттестация разработанного стандартного образца СОП-ФС-1 относительно референс-панели NIBSC 20/268, охарактеризованной в принятых ВОЗ единицах связывания антител BAU/мл (binding antibody units), с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ (48 проб), ИФА ЕИ (48 проб). По результатам статической обработки специфическая активность разработанного СОП-ФС-1 была принята за 96,8±6,8 BAU/мл антител к SARS-СоV-2. Проведенная оценка соотношения антиковидных единиц (АКЕ)

иединиц связывания (BAU) показала, что коэффициент пересчета антиковидных единиц (АКЕ/мл) в международные единицы связывания (BAU/мл) составил 4,8 для набора реагентов ИФА ГНЦ, 5,0 для набора реагентов ИФА ЕИ.

4.5.Получение вторичного стандартного образца для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в плазме крови человека

Для рутинного использования при оценке уровня специфической активности в фармацевтической субстанции для производства ЛП ИГЧ против COVID-19, был получен вторичный стандартный образец для количественного определения антител к SARS-CoV-2 (СОП-ФС-2) по той же схеме, что и СОП-ФС-1. Было установлено, что показатели качества разработанного СОП-ФС-2 соответствуют показателям качества плазмы для фракционирования

иСОП-ФС-1.

Далее было установлено значение специфической активности СОП-ФС-2 в АКЕ/мл методом ИФА с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ в модификации для количественного определения с использованием СОП-ФС-1 в качестве калибратора. Линейность и параллелизм были изучены с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ в серии не менее пяти последовательных разведений СОП-ФС-1 и СОП-ФС-2 в соответствии с инструкцией по применению компьютерной программы «Паралайн», разработанной в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича (Рис. 2).

- 14 -

В результате было установлено, что зависимости логарифмов оптических плотностей от логарифма кратности разведения для СОП-ФС-1 и СОП-ФС-2 линейны и параллельны друг другу, что соответствует критерию приемлемости. Аналогичные результаты были получены при использовании набора реагентов ИФА ЕИ.

Таким образом, было установлено, что разработанный СОП-ФС-2 по своим характеристикам идентичен СОП-ФС-1 и специфическая активность СОП-ФС-2 равна 40 АКЕ/мл.

Разработанный первичный стандартный образец (СОП-ФС-1) применяется в реакции иммуноферментного анализа для количественного определения уровня специфической активности СОП-ФС-2, выраженного в АКЕ/мл или BAU/ml.

Сиспользованием СОП-ФС-2 проведено более 200 исследований образцов

фармацевтической субстанции для производства ЛП ИГЧ против COVID-19 по показателю специфическая активность – содержанию антител к SARS-CoV-2, выраженному в АКЕ/мл или BAU/ml, методом ИФА с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ.

Глава 5. Разработка стандартного образца для количественного определения антител к SARS-СоV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19

Для оценки специфической активности готовой лекарственной формы крайне важной являлась разработка внутреннего стандарта количественного определения антител

кSARS-CoV-2 в ЛП ИГЧ против COVID-19.

5.1.Разработка стандартного образца (СОП-1) для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19

Определение активности действующего вещества в ЛП – важный этап фармацевтической разработки. В настоящее время отсутствуют международные стандартные образцы специфической активности для ЛП ИГЧ против COVID-19.

Поэтому на следующем этапе работ был приготовлен первичный стандартный образец для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в ЛП ИГЧ против COVID-19 (СОП-1). Основными задачами при получении СОП-1 согласно рекомендациям ВОЗ являлись:

– создание стандартного образца, идентичного по происхождению, составу и свойствам анализируемому материалу – ЛП ИГЧ против COVID-19;

– обеспечение постоянства содержания основного компонента стандартного образца в процессе хранения, транспортирования и использования, так как изменение этого параметра может снижать точность количественного определения антител к вирусу SARS-CoV-2 в ЛП ИГЧ.

Поставленные задачи были успешно решены благодаря тому, что сырьем для получения СОП-1 являлась производственная серия ЛП ИГЧ против COVID-19, по всем показателям качества соответствующая нормативной документации на ЛП.

Стабилизация физико-химических и биологических свойств СОП-1 достигалась путем добавления в него раствора сахарозы до конечной концентрации 8 %, стерильного розлива по 0,1 мл во флаконы, лиофильного высушивания, герметизации флаконов.

При оценке качества разработанного СОП-1 было установлено, что он соответствует показателям качества ФС.3.3.2.008.15 «Иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения», а также показателям качества лиофилизированных форм.

-15 -

Определение количества антител к SARS-CoV-2 в полученном СОП-1 проводили с использованием референтного метода – РВН. Титр ВНА в РВН составил 1/320, соответственно СОП-1 было присвоено значение активности в антиковидных единицах, равное 320 AKE/мл.

5.2. Валидация методики количественного определения антител к SARS-СоV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19 методом ИФА с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ

На следующем этапе исследований была проведена валидация методики определения концентрации антител к SARS-СоV-2 методом ИФА с использованием выбранных выше тестсистем в соответствии с ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» по следующим параметрам: аналитическая специфичность, аналитическая область, прецизионность (повторяемость (сходимость) и промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность), линейность, параллелизм. Работы проводились двумя операторами в течение двух дней с использованием разработанного СОП-1, а также трех серий ЛП ИГЧ против COVID-19 (П1, П2 и П3). Для полученных значений уровней специфических антител (АКЕ/мл) были рассчитаны величины: среднее значение, стандартное (S.D.) и относительное стандартное (RSD, %) отклонения в соответствии с ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента».

Оценка аналитической специфичности была проведена производителем коммерческих тест-систем. По данным производителя по результатам испытаний образцов сыворотки (плазмы) крови пациентов, имевших в анамнезе другие типы коронавируса, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, Adenovirus, Human Metapneumovirus (hMPV), Parainfluenza virus 1-4, Influenza A, Influenza B, Enterovirus 71, Respiratory syncytial virus, Rhinovirus, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumonia, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, EBV, ни одна из испытанных проб не показала наличие перекрестной реактивности.

Была определена аналитическая область калибровочной кривой, в пределах которой были рассчитаны отклонения полученных значений концентраций всех калибровочных стандартов от номинальных значений и коэффициенты корреляции при определении линейности калибровочной кривой (Рис. 3).

Рисунок 3 – Калибровочный график зависимости lg оптической плотности СОП-1 к уровню специфической активности АКЕ/мл (концентрация антител к SARS-CoV-2) с использованием тест-системы ИФА ГЦН

- 16 -

Также была проведена оценка прецизионности внутри цикла и между циклами. Прецизионность определяли как повторяемость (сходимость) результатов и как внутрилабораторную (промежуточную) прецизионность во всем диапазоне калибровочной кривой на шести однородных образцах в четырех повторностях для двух операторов. Результаты статистической обработки полученных результатов представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Основные валидационные характеристики методики количественного определения антител к SARS-CoV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против

корреляции не менее 0,99

Таким образом, результаты, полученные двумя исполнителями, сопоставимы и соответствуют критериям приемлемости.

Параметры линейность и параллелизм при разведении образцов были изучены в серии из пяти последовательных разведений разработанного СОП-1 и трех полученных серий ЛП ИГЧ против COVID-19 с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ в соответствии с инструкцией по применению компьютерной программы «Паралайн», разработанной в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича (Рис. 4).

Витоге установлено, что зависимости логарифмов оптических плотностей от логарифмов доз для исследуемых препаратов и СОП-1 линейны и эти линии параллельны друг другу, что соответствует критерию приемлемости. Аналогичные результаты были получены при использовании набора реагентов ИФА ЕИ.

Врезультате проведенной валидации было установлено, что метод ИФА с использованием двух наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ можно применять при количественном определении антител к SARS-СоV-2 в ЛП ИГЧ против COVID-19.

-17 -

Рисунок 4 – Изучение линейности и параллелизма методики количественного определения антител к SARS-CoV-2 с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ в сериях лекарственного препарата иммуноглобулина человека против COVID-19

5.3. Гармонизация значения специфической активности СОП-1, выраженного в АКЕ/мл, со значениями референс-панели ВОЗ, охарактеризованной в единицах связывания BAU/мл

На следующем этапе работ была проведена аттестация разработанного стандартного образца СОП-1 относительно референс-панели NIBSC 20/268, охарактеризованной в принятых ВОЗ единицах связывания BAU (binding antibody units), с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ (48 проб) и ИФА ЕИ (48 проб) – работы проводились двумя операторами в течение двух дней в двух повторностях.

По результатам статической обработки специфическая активность разработанного СОП-1 была принята за 2234,8±158,8 BAU/мл.

На следующем этапе работ была проведена оценка соотношения антиковидных единиц (АКЕ) и единиц связывания (BAU). Для этого 48 серий ЛП ИГЧ против COVID-19 были протестированы относительно международной референс-панели NIBSC 20/268, охарактеризованной в единицах связывания BAU/мл и СОП-1, аттестованного в АКЕ/мл, с использованием метода ИФА (наборы реагентов ИФА ГНЦ, ИФА ЕИ). Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Определение коэффициента пересчета антиковидных единиц (АКЕ/мл) в международные единицы связывания (BAU/мл)

Таким образом, коэффициент пересчета антиковидных единиц (АКЕ/мл) в международные единицы связывания (BAU/мл) составил 6,4 для набора реагентов ИФА ГНЦ, 7,0 для набора реагентов ИФА ЕИ.

Однако следует учесть, что международная референс-панель NIBSC 20/268 предназначена для оценки и разработки тест-систем для обнаружения и количественного определения антител к SARS-CoV-2 в сыворотках (плазме) крови человека, и ее использование для оценки уровня антител к SARS-CoV-2 в лекарственных препаратах иммуноглобулинов не изучалось.

При исследовании стабильности методом «ускоренного старения» определяли зависимость изменения активности СОП-1 от срока хранения при повышенной температуре. Температура хранения стандартного образца (Тхр) –20 оС.

Для исследования стабильности методом «ускоренного старения» выбрали несколько температурных значений (+5, +20, +37, +56 оС), при которых в течение периода наблюдения определяли уровень антител к SARS-CoV-2 и определяли экспериментальный срок годности (Сэ), при котором не происходит достоверного падения специфической активности.

Срок годности (С) при температуре хранения (Тхр) связан с экспериментальным сроком годности (Сэ) при повышенной температуре экспериментального хранения (Тэ) следующей зависимостью: С=К*Сэ, где коэффициент соответствия К=А(Тэ-Тхр)/10. Температурный коэффициент скорости химической реакции (A) принят равным 2,5.

Результаты изучения предполагаемого срока годности стандартного образца методом «ускоренного старения» представлены в таблице 5.

Таблица 5 – Предполагаемый срок хранения СОП-1, установленный методом «ускоренного старения»

* – среднее арифметическое ± стандартное отклонение

Полученные данные по оценке стабильности СОП-1 позволяют сделать вывод о том, что расчетный срок хранения стандартного образца, установленный методом «ускоренного старения», составляет 5,7 лет.

5.4. Получение вторичного стандартного образца для количественного определения антител к SARS-CoV-2

Для рутинного использования при оценке уровня специфической активности в ЛП ИГЧ против COVID-19 был получен вторичный стандартный образец количественного определения антител к SARS-CoV-2 (СОП-2) по той же схеме, что и СОП-1. Была проведена оценка качества разработанного СОП-2 и установлено, что значение показателей качества разработанного СОП- 2 соответствует показателям качества СОП-1.

Далее было установлено значение специфической активности СОП-2 в АКЕ/мл методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ

- 19 -

в модификации для количественного определения с использованием СОП-1 в качестве калибратора. Линейность и параллелизм были изучены с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ в серии не менее пяти последовательных разведений СОП-1 и СОП-2 в соответствии с инструкцией по применению компьютерной программы «Паралайн», разработанной в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича (Рис. 5).

В итоге установлено, что зависимости логарифмов оптических плотностей от логарифма кратности разведения для СОП-1 и СОП-2 линейны и параллельны друг другу, что соответствует критерию приемлемости. Аналогичные результаты были получены при использовании набора реагентов ИФА ЕИ.

Таким образом, было установлено, что разработанный СОП-2 по своим характеристикам идентичен СОП-1 и специфическая активность СОП-2 равна 200 АКЕ/мл.

Разработанный первичный стандартный образец для количественного определения антител к SARS-CoV-2 (СОП-1) применяется в реакции иммуноферментного анализа для количественного определения уровня специфической активности СОП-2, выраженного в АКЕ/мл или BAU/ml.

Разработанный СОП-2 применяется для количественной оценки и выражения в АКЕ/мл или BAU/ml антител к SARS-CoV-2, содержащихся в конечном и промежуточных продуктах на разных стадиях технологического процесса получения ЛП ИГЧ против COVID-19, методом ИФА с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ. С использованием СОП-2 проведено более 40 исследований готового ЛП ИГЧ против COVID-19 по показателю специфическая активность

– содержанию антител к SARS-CoV-2, выраженному в АКЕ/мл или BAU/ml, методом ИФА с использованием тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ.

Определена специфическая активность ЛП ИГЧ против COVID-19, составляющая не менее 160 АКЕ/мл. Показатель «специфическая активность» внесен в НД на лекарственный препарат КОВИД-глобулин, Иммуноглобулин человека против COVID-19 раствор для инфузий, 100 мг/мл.

- 20 -