Методы и методология биохимического исследования

В современной биохимии все чаще приходится иметь дело соструктурой клеток и ее органеллами. Все труднее становится провестиграницу между биохимией и биологией и между биохимией и молекулярнойбиофизикой. Применение точных физических методов позволило получитьважные данные о структуре биомолекул и механизмах их взаимодействия ифункционирования в клетке.

Существенной и характерной особенностью биохимии как наукиявляется ее методология, которую следует рассматривать с двух точекзрения:

1. Cточки зрения биологического материала:

Эксперименты можно проводить:

1. на уровне целого организма–Биохимическиеэксперименты на животных могут быть предприняты с различными целями.Применяя в течение длительного времени специальную диету, лишеннуюопределенных витаминов или микроэлементов, и одновременно регистрируявозникающие при этом физиологическиеи клинические изменения, можноисследоватьметаболическую роль данного витамина или микроэлемента.

Вместе с тем, вводя животному какое-либо экзогенное соединение,можно изучать каквлияние этого соединения на организм животного(фармакологическая или патологическая ответная реакция), так ивлияниеорганизма на введенное соединение, т. е. его превращения и выведение.

2. на уровняхоргана, тканей - Исследования на этом уровне организации проводят методомперфузииизолированных органов. Сущность этого метода заключается в том, чтоизучаемый орган (печень, почку или сердце) изолируют из организмаживотного и помещают в специальный термостатируемый прибор. Затем кперфузионной жидкости, которая обычно вводится в орган через артерию,добавляют исследуемое соединение и анализируют жидкость, вытекающуюиз органа через вену, что позволяет проследить за превращениямивведенного соединения.

3. на уровне клетки, клеточных органелл - Фракционирование (отделение) клетоксостоит из двух последовательныхстадий:гомогенизации и разделения. На стадии гомогенизации структураткани разрушается, и ткань превращается в так называемый гомогенат. Навторой стадии разделении происходит группирование отдельныхкомпонентов гомогената по принципу общности их физических свойств,таких, как размер и плотность.

При фракционировании нормальная активность клетки может взначительной степени нарушаться.

2. С точки зрения биологического материала:

1. Классическая биохимическая техника. Например, берут измельченныекусочки печени, добавляют вещество А, инкубируют при 37 градусах втечение часа, а затем измеряют концентрацию вещества А в сторонууменьшения. Если вещество А преобразуется в С, измеряют концентрацию Св сторону увеличения.

2. Изотопные методы. Радиоактивные изотопы можно использовать какпри работе с целыми организмами, так и с использованием тканей иотдельных клеток. Схема такова: животному вводят радиоактивнуюаминокислоту, далее выделяют белок, тщательно очищают его отпримесей,измеряют его радиоактивность.

3. Спектрофотометрия. Здесь используется способность различныхрастворов поглощать свет определенной длины волн.

4. Рентгеноскопический анализ. Уникальный метод, позволяющийполучить данные о пространственном расположении атомов в молекуле иликристалле. Пространственное расположение регулярно повторяющихсяатомных или молекулярных ячеек определяют путем измерения углов иинтенсивности отражения и рассеяния рентгеновских лучей определеннойдлины волны электронами, окружающими каждый атом.