4 курс / Акушерство и гинекология / Морозова_К_В_Полиморфизм_генов_ферментов_детоксикации,_антиоксидантной

моногенных заболеваний достаточно только мутаций в соответствующем гене, в развитии же группы мультифакториальных болезней играет роль сочетание генетических и экзогенных факторов (17, 21, 41).

Известно, что полиморфные гены ассоциированы и с изменениями в ферментативной системе организма (8). Наличие мутантных изоформ гена может значительно менять свойства кодируемого фермента, следствием чего являются повышение, снижение либо полная утрата его активности (41).

Доказана неоспоримая роль генов предрасположенности в этиологии и патогенезе многих тяжелых хронических заболеваний, таких как сердечнососудистые, нейро-дегенеративные, онкологические и другие, также с уверенностью можно утверждать, что наличие ряда генетических вариантов приводит к расстройствам репродуктивной системы и может способствовать патологическому течению беременности (17, 41).

В нашем исследовании проведено комплексное исследование влияния различных вариантов полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы, генов репарации ДНК и метаболизма катехоламинов на формирование риска репродуктивных потерь первой половины беременности.

1.5 Влияние оксидативного стресса на репродуктивную функцию человека.

1.5.1 Оксидативный стресс.

Немаловажную роль в генезе ранних репродуктивных потерь играет система редокс-гомеостаза, главным компонентом которой является сеть ферментов антиоксидантной системы (АОС) (35). Активные формы кислорода (АФК), образующиеся в результате ферментативных реакций в тканях организма, в норме находясь в физиологических концентрациях, регулируют важнейшие биологические процессы в клетках, такие как: митогенная активность, генная экспрессия, индукция и реализация апоптоза, модуляция иммунного ответа, антибактериальная защита, воспалительные

21

реакции и клеточная адгезия (35). Однако, при повышении концентрации АФК, либо в условиях несостоятельности АОС происходит накопление свободных радикалов в органах и тканях. В результате этих процессов в организме развивается окислительный (оксидантный) стресс. В условиях оксидантного стресса происходит окислительная модификация и инактивация белков и ферментов, усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ) с накоплением свободных радикалов, способных вызывать структурные повреждения молекулы ДНК и приводить к возникновению генных мутаций (35, 81).

По данным литературы (20, 81), свободные радикалы в условиях нормальных концентраций играют важную роль в процессах жизнеобеспечения клеток различных биологических систем, участвуя в реакциях окислительного фосфорилирования, биосинтеза простагландинов и нуклеиновых кислот, в регуляции липидного обмена, в процессах митоза, а также метаболизма катехоламинов.

Однако, роль свободных радикалов как реактогенных молекул в биологических системах изменчива, поскольку избыточное их образование может достаточно быстро привести к дезорганизации клеточных структур и нарушению функциональной активности клеток (11).

Под действием свободных радикалов и активных форм кислорода в молекулах белков происходят структурные нарушения за счет окисления некоторых аминокислот, в результате чего между ними образуются ковалентные "сшивки", всё это активирует клеточные протеолитические ферменты, гидролизующие повреждённые белки. Особенно важно подчеркнуть, что происходит нарушение мембранных структур, изменение транспорта ионов Са2+, что угрожает жизнеспособности клетки. Активные формы кислорода легко нарушают и структуру ДНК (17, 41).

Процессы ПОЛ в организме контролируются антиоксидантной системой. В случае первичной недостаточности антиоксидантной защиты происходит неполная инактивация продуктов ПОЛ, в результате чего даже

22

физиологические концентрации свободных радикалов оказывают токсическое воздействие на клетки организма. Повышенная активность перекисного окисления липидов может возникнуть в результате избыточного образования активных форм кислорода под воздействием стрессового фактора при нормальном функционировании антиоксидантной системы (51, 97).

Другой причиной активации ПОЛ может являться генерализованная гипоксия, развивающаяся вследствие нарушений центральной и периферической гемодинамики (97).

Все процессы образования свободных радикалов находятся под контролем системы антиоксидантной защиты (51).

Во время беременности роль антиоксидантной защиты особенна актуальна. Взрыв оксидативного стресса возникает в плаценте в момент формирования маточно-плацентарного кровотока (10-12 неделя), когда наступает необходимость адаптации дочернего организма к среде материнской крови. Именно в этот момент особенное значение имеет слаженное функционирование ферментов антиоксидантной системы (91). Воздействие оксидативного стресса на эмбрион реализуется через нарушение мембранной стабильности клеток, процессов клеточного роста и апоптоза во время развития эмбриона, что в условиях недостаточности антиоксидантной системы может привести к потере беременности (113, 124).

Предметом нашего исследования является полиморфизм генов, отвечающих за функционирование антиоксидантной системы, поэтому хотелось бы более подробно остановиться на каждом из них.

1.5.2 Роль транскрипционного фактора NRF2 в регуляции антиоксидантной системы организма.

Функционирование и регуляция антиоксидантной защиты организма осуществляется благодаря многоступенчатому слаженному взаимодействию целого ряда белков и ферментов. Одним из регуляторных звеньев

23

антиоксидантной системы является транскрипционный белок, кодируемый геном NRF2. При возникновении оксидантного стресса активация транскрипционного белка приводит к запуску экспрессии антиоксидантных ферментов. В результате каскада реакций с участием ферментов антиоксидантной системы происходит нейтрализация свободных радикалов

(29, 51).

Ген NRF2 располагается на 2 хромосоме и является ответственным за экспрессию полноценно активного танскрипционного белка (80, 144). В случае изменения структурных характеристик гена происходит формирование полиморфных вариантов, ведущих к выработке недостаточного количества белка, что в условиях оксидантного стресса тормозит активацию защитных ферментов, ставя под угрозу жизнедеятельность клеток органов и тканей (143).

Известно несколько вариантов полиморфизма гена NRF2, определяющих разный уровень выработки транскрипционного белка. По данным литературы (143), минорный аллель Т полиморфизма rs6721961, при котором происходит замена азотистого основания гуанина на тимин в 617 позиции, приводит к понижению выработки транскрипционного фактора, что ассоциировано с риском рака легких, особенно среди курильщиков.

В исследовании (89) установлено, что генотип Т/Т повышает риск венозных тромбозов на фоне заместительной гормональной терапии эстрогенсодержащими препаратами у пациенток в постменопаузе. Существуют указания на ассоциированный с генотипом Т/Т повышенный риск развития олигоастенозооспермии (162). Также, по результатам некоторых исследований, носительство аллеля Т (генотип Т/Т) rs 6721961 и генотипа A/A rs2706110 повышает риск возникновения рака молочной железы (108).

Согласно приведенным выше данным, носительство различных полиморфных вариантов гена NRF2 может сопровождаться повышенной уязвимостью организма, при недостаточности транскрипционного фактора.

24

Возникающий в результате дефект защитных систем приводит к нарастанию повреждающего воздействия чужеродных соединений. Принимая во внимание взаимосвязь полиморфизма гена NRF2 с повышенным риском развития различных заболеваний, можно предполагать и его значимость для процессов формирования и развития беременности в первой половине гестации, что и является предметом нашего исследования.

1.5.3. Супероксиддисмутаза, как один из основных факторов антиоксидантной защиты.

Одним из наиболее значимых звеньев антиоксидантной защиты организма является фермент супероксиддисмутаза (CОД). СОД представлена семейством металлоферментов, регулирующих уровень О2- в клетке путем катализации реакции дисмутации супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода и воды. Супероксиддисмутаза находится во всех клетках, потребляющих кислород, и защищает мембраны клеток всех аэробных организмов от повреждающего действия свободных радикалов (34, 35, 86). В организме СОД представлена тремя изоформами, различающимися ионами металлов [Zn2+] , [Cu2+]и [Fe2+], входящими в состав их активных центров: СОД 1 [Cu,ZnСОД], находится в цитоплазме, СОД 2 [Mn-СОД] в митохондриях, и СОД 3 [Fe-СОД]. - внеклеточная (экстраклеточная) форма находится преимущественно в плазме, лимфе, синовиальной жидкости (86, 128).

Недостаток СОД приводит к снижению защитных функций организма и повреждению клеток свободными радикалами, однако слишком высокий уровень СОД может привести к переизбытку в организме перекиси водорода, и как следствие к токсическому повреждению клеток.

Высокой активностью СОД отличаются эритроциты, что позволяет использовать кровь как источник для выделения и очистки фермента (35).

Одним из основных генов, отвечающим за эффективность

антиоксидантной защиты организма, является ген SOD2, расположенный на 6

25

хромосоме, изменчивость в структуре которого влияет на количество и активность вырабатываемой клетками супероксиддисмутазы 2 (35).

Полиморфизм rs 4881 приводит к замене аминокислоты аланина на аминокислоту валин в 16 позиции, изменяет вторичную структуру белка и может влиять на перенос фермента из цитоплазмы в матрикс митохондрий. По данным разных авторов, такой вариант полиморфизма приводит в той или иной степени к дефициту кодируемого фермента (156). Активность СОД2 может отличаться до 56 раз у носителей разных аллельных вариантов. По данным литературы (137), у носителей Т/С и T/T вариантов активность фермента выше на 33% по сравнению с носителями C/C варианта. Наиболее исследован данный вариант полиморфизма SOD2 в генезе онкологических заболеваний, гипертонической болезни, нейродегенеративных состояний, обусловленных повреждающим действием на клетки оксидативного стресса. Носительство генотипа С/С увеличивает риск кардиогенного шока при дилатационной кардиомиопатии, также с данным генотипом ассоциирован повышенный риск заболеваемости раком желудка среди китайского населения (93, 161).

Недавно изучена роль полиморфизма SOD2 в развитии ранних репродуктивных потерь (82). Установлено, что носительство супружеской парой аллельного варианта С/С ассоциировано с повышенным риском неразвивающейся беременности в I триместре. Существуют данные о более высокой вероятности возникновения беременности при проведении ЭКО у носителей генотипа Т/Т (131).

1.5.4 Каталаза, как один из основных факторов антиоксидантной защиты.

Каталаза - фермент антиоксидантной системы, является гемопротеином класса оксидоредуктаз, катализирующий реакцию обезвреживания пероксида водорода, образующегося в результате реакции дисмутации супероксидного радикала. Функция каталазы заключается в защите организма от активных

26

кислородсодержащих радикалов и пероксида водорода. Реализация функции каталазы происходит в большей степени при высоких концентрациях перекиси водорода, так как при низких концентрациях обезвреживание происходит преимущественно под действием пероксидазы (51).

Каталаза весьма распространенный фермент, она присутствует почти во всех аэробно дышащих клетках и у некоторых факультативных анаэробов, преимущественно находится в пероксисомах, внеклеточно каталаза встречается в незначительных концентрациях (25).

В условиях гипоксии усиление окислительных процессов способствует образованию большего количества перекисных соединений, что приводит к необходимости компенсаторного увеличения концентрации каталазы для защиты клеток от интоксикации (25).

Ген САТ располагается на 11 хромосоме и отвечает за экспрессию фермента каталазы - важного звена антиоксидантной системы организма

(26).

По результатам проведенных исследований, была установлена связь носительства нескольких полиморфных вариантов гена САТ с развитием ряда мультифакториальных заболеваний.

Генотипы G/G rs769214, А/А rs7943316 (=rs17880664) и Т/Т

полиморфного варианта rs1049982 оказались ассоциированы с риском

мужчин, а генотипы А/Т и Т/Т, напротив, выполняли протективную функцию в отношении этих заболеваний в группе мужчин, ведущих здоровый образ жизни (151). При наличии полиморфного варианта rs1001179 (С262Т) гена CAT происходит замена цитозина на тимин в 262 позиции, что приводит к экспрессии неполноценной формы фермента, обладающей меньшей защитной активностью. По данным некоторых авторов (47, 94, 160) носительство генотипа Т/Т достоверно ассоциированно с повышенным

27

риском развития заболеваний сердечно-сосудистой системы, бронхиальной астмы, с риском развития инсулиннезависимого сахарного диабета. Также существуют работы, по результатам которых сделан вывод о связи аллеля Т в гомо- и гетерозиготном состоянии с предрасположенностью к развитию язвенного колита, есть данные о повышении риска рака молочной железы у женщин с аллелем rs1001179–Т на фоне заместительной гормональной терапии в постменопаузе (112). Генотип Т/Т ассоциирован также с повышенным риском рака простаты у мужчин среди турецкого населения (147). Однако, присутствие минорного генотипа Т/Т, согласно данным некоторых исследований (129, 132) может играть не только отрицательную, но и положительною роль в структуре заболеваемости. Так, по данным литературы (129), аллель Т в гомозиготном состоянии rs1001179 обуславливает снижение риска развития невриномы слухового нерва и мужского бесплодия.

На основании результатов перечисленных выше исследований можно сделать вывод о неоспоримой роли изменчивости гена САТ в возникновении предрасположенности к различным соматическим заболеваниям, на основании чего предполагается возможность наличия взаимосвязи полиморфизма данного гена с патологией репродуктивной системы.

1.5.5 Глутатионпероксидаза, как один из основных факторов антиоксидантной защиты.

Другим важнейшим элементом антиосидантной защиты является глутатионпероксидаза (ГП) – гомотетрамерный селенопротеин. ГП превращает перекись водорода и липидные пероксиды в безвредные молекулы до того, как они образуют свободные радикалы. Это селензависимый фермент, поэтому активность глутатионпероксидазы напрямую зависит от содержания селена в крови. Дефицит селена в

28

организме снижает активность ГП, а введение селена приводит к ее повышению (51).

Фермент глутатионпероксидаза локализован в цитозоле в небольших количествах, а также в митохондриях. Хотя роль каталазы и ГП для клетки при восстановлении H2O2 приблизительно одинакова, для организма в целом активность ГП значительно важнее (81).

Известно несколько генов, кодирующих разные формы глутатионпероксидаз, отличающиеся по локализации в организме. ГП 1 (GPx1) является наиболее распространенной формой фермента, и обнаружена в цитоплазме практически всех тканей млекопитающих. ГП 2 (GPx2) экспрессируется в кишечнике и является внеклеточным ферментом, ГП 3 (GPx3) также является внеклеточным ферментом и в основном встречается в плазме. ГП 4 (GPx4) имеет большое значение в метаболизме пероксидов липидов и экспрессируется практически во всех клетках млекопитающих на более низких уровнях (86).

Предметом нашего исследования является полиморфизм гена GPx4, локализованый на 19 хромосоме, и контролирующий экспрессию селенсодержащего фермента ГП 4 (35).

В литературе описано несколько аллельных вариантов гена GPX 4. Наибольшего внимания заслуживает однонуклеотидный полиморфизм rs713041 (С44Т) гена GPX4, при котором происходит замена цитозина на тимин в 44 сайте. Носительство генотипов С/Т и Т/Т приводит к экспрессии неполноценного по своей активности фермента глутатионпероксидазы 4, что может повышать уязвимость организма под воздействием свободных радикалов. По данным разных авторов (99, 122), носительство генотипа Т/Т ассоциировано с повышенным риском заболеваемости раком молочной железы, церебрального инсульта у больных эссенциальной гипертензией при носительстве генотипа Т/Т и С/Т (126). Генотип Т/Т обеспечивает повышенный риск сердечно-сосудистых заболеваний за счет ослабления функций клеток эндотелия (99).

29

По результатам исследований Bermano G,2007 (88) носительство аллеля С (генотип Т/С) rs713041 ассоциировано с риском развития колоректального рака. Гетерозиготный генотип С/Т ассоциирован с риском рака легких и гортани. По данным Villette S., 2002 (153) существует связь данного варианта полиморфизма с уровнем синтеза лейкотриенов и, как результат, участие в течении воспалительных процессов. Известно, что при носительстве генотипа С/С уровень вырабатываемых лейкотриенов выше, чем при генотипах С/Т и Т/Т (153).

Недавно описан полиморфизм T2650C гена GPX4, при котором происходит замена тимина на цитозин в 2650 позиции. Наличие гомозиготного генотипа дикого типа T/T ассоциировано с пониженным риском развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у женщин и постоянной формой артериальной гипертензии у мужчин. Примечательно, что наличие у женщин гетерозиготного генотипа T/C гена снижает риск развития как язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, так и язвенной болезни желудка (75).

Изученные полиморфные варианты гена GPX4 образуют гаплотип

(rs757229-rs757230-rs4588110- rs3746165-rs3746166: C-G-G-T-A), по данным

Liu SY,2011 (119) повышающий защиту от мужского бесплодия, связанного с астенозооспермией и олигоспермией. Существуют данные о связи гаплотипа (rs713041rs4807542) гена GPX4 с риском развития местной остеоартропатии (Болезнь Кашин-Бекка ) среди китайского населения (103).

Таким образом, основываясь на связи вариантных аллелей данного гена с формированием описанных выше мультифакториальных заболеваний можно предположить, что изменения в его структуре влияют и на течение беременности.

30