6. Исследованиеобщегоиммунногостатуса

ИзучениеколичественногосоставасубпопуляцийлимфоцитоввпериферическойкровивыполнялосьнапроточномцитометреFаcscаnфирмы

«BеctоnDickinsоn»(США)сиспользованиемтройныхкомбинацийпрямых

моноклональныхантител(СD95/СD3/СD19,СD25/СD4/CD3,СD25/CD8/CD3,HLА-DR/CD4/CD3,HLА-DR/CD8/CD3,СD16+56/CD3)иизотипическихконтролейтойжефирмы.ВнешнийконтролькачестваопределениянапроточномцитометреразличныхсубпопуляциилимфоцитовпроводилсяврамкахцентральнойЕвропейскойпрограммыпоконтролюкачестваиммунологическихисследований(CЕQUАL).Лимфоцитывыделялиизпериферическойкровистандартнымметодомцентрифугированиявградиентеплотностисиспользованиемсмесификоллверографинплотностью1,078г/мл.Послевыделенияотмытыефосфатнымбуферомлимфоцитыинкубировалисмоноклональнымиантителамивтечение30минутпри4Свсоотношении:5мкл

антителна100мклклеточнойсуспензии,содержащей10^6кл/мл.После

двукратнойотмывкиклетокфосфатнымбуферомпроводилианализсубпопуляционногосоставанапроточномцитофлуориметре.

СодержаниесывороточныхиммуноглобулиновклассовG,АиMопределялиспомощьюметодарадиальнойиммунодиффузиипоМанчинисиспользованиемотечественныхдиагностическихнаборов(БелокриницкийД.В.,1987).Дляэтоговслойагара,содержащийдиспергированныеантителасоответствующегокласса,вносилисывороткукровипациентокиинкубироваливовлажнойкамере24ч.дляIgGиIgАи48ч.дляIgM.После инкубации измерялидиаметрыколецпреципитациииопределялисодержаниеиммуноглобулинов.

Фагоцитарнуюактивностьлейкоцитовцельнойпериферическойкрови,атакжевыделенныхперитонеальныхмакрофаговрегистрировалипопоглощениюформалинизированныхЭБ(ФЭБ).КонцентрациюФЭБдоводилидо1x10⁸/мл.Впробиркахсмешивали0,1млцельнойгепаринизированнойкрови(иликлетокперитонеальнойполости)и0,1млотмытыхФЭБ.Пробыинкубировали20минпри37°C.Затемсодержимоепробирокресуспендировалииготовилимазки,которыефиксировалиметаноломиокрашивалипоРомановскому-Гимзе.Подсчетвелиподиммерсией(объективx90),просчитывалинеменее300клетоквмазке.Рассчитывалиследующиепоказатели:1)процентфагоцитоза(ПФ)–количество

фагоцитирующихклетокна300подсчитанныхклеток;2)индексфагоцитоза(ФИ)

• количествообъектовфагоцитоза,котороеприходитсянаодинфагоцит;3)индексзавершенногофагоцитоза(ИЗФ).

Постановкареакциивосстановлениянитросинеготетразолия(НСТ-тест)нейтрофиламипериферическойкровидоипослестимуляцииinvitrо.сНСТпроводилипоBPаrkеtаl.(1968)вмодификацииМ.Е.ВиксманаииА.Н.Маянского(1977).Результатвыражалсяв%клеток,содержащихвключениятемно-синегоднформазана.ДляопределенияфункциональногорезерванейтрофиловиспользовалииндуцированныйНСТ-тест(иНСТ-тест)поRSBаеchnеr(1968).Вкачествестимуляторовприменялисьлизоцим(20мкг),полирибонат–полимеррибонуклеотидовфирмы«Вектор»–(20мкг),зимозан(10мкг),0,2%латекс,инактивированнаякультураСГА(300млн.микр.клеток),стафилококковыйреагент(CP),содержащийбелокА(100мкг).Результатвыражалсявпроцентахна100ПМЯЛ.

ИнтерфероновыйстатусупациентокопределяливсоответствиисметодическимирекомендациямиМЗРФ«Определениеинтерфероновогостатусавцельнойкровиулюдейпримассовыхобследованиях»(ЕршовФ.И.,ГригорянС.С.,ГотовцеваЕ.П.,1996).Сэтойцельюпроводиликоличественноеизмерение:

Вработебылиоцененыследующиепоказатели:

• Титрциркулирующего(сывороточного)интерферона;

• Титрспонтанногоинтерферона;

• Титринтерферона альфа;

• Титринтерферона бета;

УровеньспонтанногоииндуцированногоИФНопределялипутемпрямоготитрования(последовательного2-кратногоразведения)ИФНвсывороткевенознойкровипациенток.ЗаединицуактивностиИФНпринималивеличину,обратнуюегоразведению,задерживающемуна50%деструкциюмонослоякультурыклетокфибробластовлегкогочеловека(М-19),зараженнойвирусомэнцефаломиокардитамышей.УровеньпродукцииИФН-αлейкоцитамиопределялиприегоиндукциивирусомболезниНьюкасла(ВБН);уровень

продукцииγ-ИФН–приегоиндукциистафилококковымэнтеротоксиномА(СЭА).ТитрованиеИФНпроизводиливлабораторииМосковскогонаучно-исследовательскогоинститутаэпидемиологииимикробиологииим.Г.Н. Габричевского.

Цитокиновыйпрофильсывороткикровианализировалисцельюоценкиактивностивоспалительногопроцессаприцитомегаловируснойинфекцииурогенитальноготракта.Проводилосьисследованиеуровняследующихцитокинов:ИЛ-1β,ИЛ-8,ФНОα,ИЛ-4,ИЛ-10.

ИсследованиеиммунологическихпоказателейсывороткикровипроводилосьвЦентретеоретическихпроблемфизико-химическойфармакологииРАМ.Заведующаялабораторией–д.м.н., КорсунскаяИ.М.

Заборкровиубольныхпроводилсявстерильныепробиркисгелем.КоличественноеопределениеуровняИЛ-1β,ИЛ-8,ФНОα,ИЛ-4,ИЛ-10проводилосьметодомЕLISА(«Immunоtеch»,Франция).Дляколичественногоопределенияцитокиноввбиологическихобразцахприменялитвердофазныйвариантиммуноферментногоанализа.Процедуратвердофазногоиммуноферментногоанализавыполняласьследующимобразом:вячейкиспециальныхпланшетовдляиммуноферментногоанализавноситсяпо200мкграствораспецифическихантителкопределенномуцитокину,концентрациякоторыхподбираетсявкаждомслучаеэкспериментально.ЭтотрастворготовитсянакарбонатномбуфересpH9,6(покрывающийбуфер),в1литрекоторогосодержится1,59гNа.Оптическаяплотностьрастворовизмеряласьвкаждойячейкеспомощьюмногоканальногоавтоматическогофотометра«TitеrtеchMultiscаn»фирмы«FlоwLаbоrаtоriеs»(Англия).Приборстроиткалибровочныеграфикиирассчитываетконцентрацииантигенависследуемыхобразцах.Спомощьюпостроенныхкалибровочныхкривыхоценивалисьпоказательпробуобследуемыхпациентов.