6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Клиническая_лабораторная_диагностика_Учебник_В_В_Долгова_2016
.pdfцентрифуги должна быть приложена таблица (номограмма), определяющая зависимость между числом оборотов и величиной центробежной силы конкретного ротора.
Дистилляция. Вода для лабораторных исследований должна быть без примесей, от ее качества во многом зависят результаты многих биохимических тестов. В лабораториях используется несколько категорий воды по качеству очистки.
Дистиллированная вода – вода, полученная путем выпаривания и последующей конденсации (перегнанная вода), она характеризуется стерильностью, очисткой от нерастворимых частиц, но плохой очисткой от растворенных ионизированных катионов и анионов. Дистиллированная вода является апирогенной, т.е. не содержащей возбудителей, поэтому при внутривенном введении растворов, приготовленных на этой воде, не может возникнуть лихорадки. В ней сохраняются такие ионизирующиеся примеси как аммиак, СО2 и Cl. Дистиллированная вода имеет, как правило,
сопротивление 0,25-0,35 мегом-см или удельную электропроводимость 3-4
мкS/см (S – симменс). Для приготовления реактивов для клинической биохимии может быть использована вода с проводимостью менее 20 мкS/см.
Из-за растворённой углекислоты дистиллированная вода имеет слабокислую среду, её pH составляет 5,4-6,6. Почти все газообразные вещества способны в той или иной мере растворяться в воде или органических растворителях.
Некоторые из них, например NH3, HCl, жадно поглощаются водой. Другие же газы (кислород, водород) обладают меньшей или незначительной растворимостью в воде, причем она зависит от температуры воды и внешнего давления. Чем выше парциальное давление газа, тем больше он растворяется в воде, и чем выше температура воды, тем меньше растворимость газов.
Поэтому воду для удаления растворенных в ней газов кипятят. Для получения полностью нейтральной воды её кипятят до полного удаления углекислого газа (в течение 30 минут) и хранят в герметичной таре.
101
Бидистиллированная вода – дважды очищенная вода, полученная перегонкой дистиллированной воды в кварцевом аппарате – бидистилляторе,
близка к химически чистой воде. Бидистиллированная вода характеризуется повышенной химической активностью; при хранении и применении нужно предпринимать особые методы предосторожности для исключения возможности загрязнения бидистиллированной воды
Фильтрованная вода – вода, полученная путем фильтрации через керамические фильтры с диаметром пор 0,9 мкм. Такая вода очищается практически только от нерастворимых примесей и бактерий, но содержит соли и вирусы, т.е. является пирогенной. В лабораториях может применяться для приготовления красителей.
Деионизированная вода – вода, полученная методами ионного обмена,
обратного осмоса или комбинацией этих способов. Такая вода имеет проводимость не более 5 мкS/см и рекомендуется для аналитических работ по клинической биохимии. Деионизованная вода практически не содержится ионов. Абсолютно чистая вода имеет проводимость 0,055 мкS/см и соответственно удельное сопротивление составляет 18 МОм·см (M -см).
Деионизацию осуществляют с помощью ионообменных смол.
Используют смолы двух типов: катионитные R-H (R-органический радикал)
ианионитные R-OH. Ионы металлов связываются на катионите.
Отрицательные ионы кислотных остатков осаждаются на анионите.
Образовавшиеся ионы H и OH объединяются в молекулу воды. Возможно предварительное использование процесса обратного осмоса. Для раздавления биопроб и реактивов лучше использовать деионизированную воду,
полученную методами ионного обмена и обратного осмоса.
Техника приготовления растворов. Химические реактивы
выпускаются промышленностью с различной степенью очистки. В
клинических лабораториях находят применение реактивы, в основном,
следующих четырех типов квалификации чистоты:
102
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
Технический – на этикетке обозначается буквой «Т», содержит значительное количество примесей, для выполнения анализов непригоден.
Используется только для подсобных целей. Например, техническая серная кислота применяется для приготовления хромовой смеси.
Чистый – имеет до 0,1% примесей, на этикетке обозначается буквой
«Ч».
Чистый для анализа – содержание примесей не превышает 0,07%. На этикетке обозначается буквами «ЧДА».
Химически чистый – содержит примеси не более 0,03%. На этикетке обозначается буквами «ХЧ». Последние три типа чистых реактивов используются непосредственно для проведения биохимического анализа.
Растворители следует применять только чистые независимо от того,
какие по точности готовят растворы. Если растворителем служит вода, то можно применять только дистиллированную или деионизированную воду, в
отдельных случаях бидистиллят.
Лабораторная посуда должна быть чистой. Предварительно подготавливают соответствующей емкости посуду, в которой будут готовить и хранить получаемый раствор. Если нужно приготовить 1 л раствора, то для растворения следует взять посуду емкостью не больше 1,5 л. Если готовят
10 л раствора, то бутыль должна быть емкостью не больше 12-13 л.
При особо точных и ответственных анализах следует обязательно принимать во внимание возможность выщелачивания стекла и применять,
если это допустимо, кварцевую посуду или такую, стекло которой не содержало бы искомый элемент. Так, неизбежна ошибка при определении алюминия, свинца и некоторых других элементов в посуде из стекла,
содержащего эти элементы.
Вся посуда, контактировавшая с кровью, подвергается очистке от остатков материала и дезинфицируется в соответствии с действующими правилами санэпидрежима. Обычно хорошая очистка достигается уже после замачивания посуды в моющем комплексном растворе. Затем посуда
103
промывается проточной водой и ополаскивается дистиллированной водой. С
хорошо вымытой посуды вода стекает струйками, не задерживаясь в виде капель. После сушки она абсолютно прозрачная и не имеет подтеков.
Высушивают посуду в сухожаровых шкафах. Можно сушить и на любых приспособлениях, где обеспечивается свободный отток воды с посуды.
В лабораториях удобно пользоваться посудомоечными машинами, в
которых используется ультразвуковая очистка поверхностей. Если в загрязненной посуде был или мог быть инфицированный биологический материал, она перед тем, как закладываться в моечную машину, должна быть стерилизована согласно санитарным правилам работы с соответствующим материалом. Лабораторная посудомоечная машина имеет ванну с крышкой,
обычно объемом 3-10 л, в которую заливают моечный раствор и кладут посуду, она обрабатывается ультразвуком при температуре до 60°С, после чего промывается чистой водой.
При работе на современных лабораторных анализаторах используется разовые пробирки, мытье которых не предусматривается. Они дезинфицируются и уничтожаются согласно действующим санитарным нормам, как правило, специализированными компаниями по прописанной технологии.
Растворы щелочные нельзя оставлять надолго в фарфоровой и особенно в стеклянной посуде. Если приходится их оставлять, то необходимо вначале нейтрализовать растворы, потом немного подкислить и хранить только подкисленные растворы. Скорость растворения твердого вещества зависит от размера его частиц. Чем крупнее частицы, тем медленнее идет растворение. Поэтому перед растворением твердого вещества его следует измельчить и отвешивать для растворения только измельченное вещество.
Сказанное не относится к гигроскопичным веществам, так как последние в измельченном виде очень легко поглощают влагу из воздуха вследствие большого увеличения поверхности. Поэтому гигроскопичные вещества растворяют, не измельчая, разве только быстро разбив большие куски.
104
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
Некоторые правила работы с реактивами:
1.Емкости с реактивами, утратившие этикетки с указанием состава их содержимого, из работы изымаются. Это же относится к реактивам с истекшим сроком годности.
2.Определяя запах реактива, соответствующую емкость держат на расстоянии, направляя к себе движением ладони пары вещества. Это позволяет предотвратить химический ожог слизистых носа и глаз.
3.Приготовляя растворы кислот, следует иметь в виду, что кислота добавляется в последнюю очередь, то есть кислоту наливают в воду, а не наоборот. Иначе это может привести к сильному разогреву смеси вплоть до ее закипания и разбрызгивания кислоты. Особенно это характерно для серной кислоты.
4. Повысить величину растворимости вещества можно, нагревая емкость с раствором на водяной бане. Но это справедливо только для веществ,
растворение которых протекает с поглощением тепла. Нагревать растворы веществ можно лишь до определенной температуры, чтобы не вызвать разложение вещества.
5.Перед взвешиванием реактивы, хранившиеся в холодильнике, должны быть выдержаны при комнатной температуре не менее 20 минут.
2.6. Методы клинических лабораторных исследований
Фотометрические методы анализа. Фотометрический анализ – один из самых распространенных методов, он характеризуется высокой чувствительностью и возможностью определения большого количества веществ. При фотометрическом анализе используется способность химических соединений поглощать лучистую энергию определенных длин волн. Открытие новых реагентов, образующих окрашенные соединения с веществами, разработка принципов сопряженных реакций, оснащение лабораторий биохимическими анализаторами делает применение этого
105
метода одним из самых распространенных в КДЛ. Инструментальные методы позволяют использовать спектры поглощения, лежащие как в ультрафиолетовой, так и в инфракрасной областях спектра. Фотометрические исследования проводятся на фотометрах и спектрофотометрах. Фотометры – оптические приборы, позволяющие измерять световой поток на фиксированных длинах волн. Сплошные спектры изучаются с помощью спектрофотометров.
Абсорбционная фотометрия. Определение концентрации окрашенного вещества в растворе оптическими методами основывается на законе Бугера-Лаберта-Бера, который формулирует выражение для оптической плотности: D = С·l ,где D – оптическая плотность раствора или абсорбция, С – концентрация поглощающего вещества, l – толщина кюветы, через который проходит свет, – молярный показатель поглощения (экстинкции), зависящий от длины волны и природы вещества.
Молярный показатель поглощения ελ является константой данного раствора вещества при данной длине волны оптического излучения. Величина оптической плотности D безразмерна, но может исчисляться в «беллах»
(сокращение – Б). Таким образом, закон Бугера-Ламберта-Бера устанавливает, что абсорбция светового потока определенной длины волны
( А ) прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества. В
кювете с фиксированной длиной оптического пути (в клинической химии принята стандартная кювета в 1 см) абсорбция и концентрация связаны через коэффициент молярной абсорбции.
Для каждого вещества характерен свой спектр поглощения, причем он часто разный для окисленных и восстановленных форм. На изменении спектра поглощения при переходе окисленная восстановленная форма аналитов основано определение концентрации большинства субстратов и активности практически всех ферментов. Исследование аналитов рекомендуется проводить при длине волны облучения, соответствующей
106
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
максимальному поглощению, то есть длине волны, при которой максимален коэффициент молярной экстинкции . Это связано с тем, что при максимальном максимальна чувствительность фотометрического определения изменений концентрации аналита.
Прямая пропорциональность между абсорбцией и концентрацией сохраняется в пределах определенного оптического диапазона, который является характеристикой конкретного оптического прибора. Линейный
оптический диапазон прибора устанавливается экспериментально
(приводится в технических характеристиках прибора). В современных фотометрах и биохимических анализаторах линейный оптический диапазон составляет от 0,1 до 2,5 и даже 3,0 ед. оптической плотности.
Разрешение или чувствительность оптической системы – это та минимальная разница в оптической плотности раствора в кювете в 1 см,
которую может различить прибор. Современные фотометры позволяют измерять растворы с разрешением до 0,001 ед. оптической плотности. Чем выше разрешение, тем с большей точностью данная система способна измерять концентрацию (активность) аналитов. Разрешение зависит от абсолютного значения оптической плотности. Вне линейного диапазона оптической плотности (< 0,1 или > 3 ед. оптической плотности) разрешение
ухудшается.
Ограничения по диапазону оптической плотности накладывают соответствующие ограничения на диапазон измеряемых концентраций аналитов. Результатом этого является то, что абсорбционная фотометрия надежно регистрирует изменения содержания аналитов в пределах 1-2
порядков и не более. Этого достаточно для определения изменений концентраций основных биохимических показателей, таких как общий белок,
билирубин, глюкоза и изменений активностей ферментов аминотрансфераз,
фосфатаз, дегидрогеназ. В общем виде – это скрининговые показатели
«биохимического благополучия» или «биохимической патологии». Однако
количественные |
изменения |
конкретных |
метаболитов |
(гормоны, |
|
|
107 |
|
|
онкомаркеры, компоненты протеолитических систем), определение которых
диагностирует нозологическое заболевание, методами абсорбционной фотометрии определить не удается. Для этой цели применяются иммунохимические методы.
Особенности фотометрической схемы биохимических
анализаторов. Основой функционирования биохимического анализатора является одновременное получение многопараметрической информации. Для этого биохимические анализаторы оснащены, как правило, полихроматором
(рис. 2.2), который позволяют одновременно регистрировать оптическую плотность исследуемых растворов на нескольких длинах волн.
Источник света (лампа) находится внутри карусели с измерительными кюветами, в которых содержатся пробы для измерения. Карусель через фиксированные промежутки времени, например через 15 с, совершает оборот, при котором все кюветы освещаются белым светом, проходящим через входную щель. Прошедший через кювету свет разлагается на дифракционной решетке в спектр и измеряется серией детекторов, каждый из которых настроен на определенную длину спектра, включая измерение в ультрафиолете и ближнем инфракрасном диапазоне (полихроматор). Для монохроматических измерений оценивается сигнал с одного из 12
детекторов, а при бихроматическом измерении берутся одновременно результаты с 2 детекторов. Бихроматическое измерение дает более устойчивые результаты, поскольку можно компенсировать флуктуацию в условиях измерения, таких как напряжение источника питания, температура и др.
108
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
Рис. 2.2. Принципиальная схема основных узлов фотометрического блока биохимического анализатора. Использование одновременно 12 фотодиодов, регистрирующих одновременно сигналы разных частей спектра, является основным компонентом полихроматора
Компьютер анализирует результаты измерений, представляет результаты в конечном виде, кроме того, компьютер через соответствующие датчики контролирует работу практически всех узлов анализатора.
Таким образом, в биохимических анализаторах измеряются многократно многочисленные кюветы с пробами по нескольким спектральным характеристикам, а компьютер по заданной программе выбирает необходимые сигналы и на основе их анализа рассчитывает концентрацию или активность аналитов.
Фотометрические методы определения аналитов. Измерение по
калибровочной кривой
Для построения калибровочных графиков используют несколько концентраций определяемого вещества, изготовленного в качестве
109
калибратора с разным уровнем концентрации, определенной точным референтным методом. На оси абсцисс откладывается концентрация, а на оси ординат – абсорбция. Если закон светопоглощения соблюдается, график будет иметь вид прямой линии, проходящей через нулевую точку (рис. 2.3,
график А).
|
|
|
Б |
|
абсорбция |
|
|
А |
|
|
|
В |
|
|
|
|
|
|
|
С1 |
С2 |
С3 |
С4 |
С5 |
Рис. 2.3. Варианты при построении калибровочного графика при линейной зависимости экстинкции от концентрации исследуемого вещества:
А – закон Бугера-Ламберта-Бера соблюдается, прямая выходит из нулевой точки, правильный вариант калибровочного графика
Б – имеет место влияние систематического фактора, желательно измерение по сравнению с холостой пробой, в которой бы этот фактор учитывался.
В – измерение неверное, низкие концентрации вещества не измеряются
Возможны варианты при построении калибровочного графика. Если получается график Б (см. рис. 2.3), то использовать его можно, но имеется систематический сдвиг, который необходимо учитывать при расчете фактора. Если получается график В, то пользоваться им нельзя, так как не определяются по этому графику низкие концентрации калибратора. Расчеты по калибровочным графикам обычно используют для методов, при которых имеются стабильные результаты изо дня в день (гемоглобин, общий белок).
При работе на современных анализаторах оператору фактически приходится проводить калибровку каждый день, при этом построение и использование
110
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/