Во внешней среде пневмококки погибают в течение 3-4 недель. Нагревание до 85°С выдерживают в течение 30 минут. За 1-2 минуты гибнут от воздействия 1% раствора формалина, 2% раствора едкого натра, 10% взвеси свежегашеной хлорной извести.

Факторами патогенности пневмококка являются капсула и субстанция С (тейхоевая кислота клеточной стенки, содержащая холин, специфически взаимодействующий с С-реактивным белком).

Микробиологическая диагностика пневмококка основана на использовании теста чувствительности к оптохину (это вещество угнетает 100% пневмококка), способности ферментировать инcулин, а также чувствительности к солям желчных кислот (дезоксихолатной пробы - лизис пневмококков в присутствии желчных кислот).

Student TJ

Тема: Микробиология коринобактерий и бордетелл Вопросы для обсуждения:

1.Биологическая характеристика коринобактерий диф -терии. Факторыпатогенности, характеристика токсина.

2. Формы инфекции (носительство, клинические формы заболевания). 3.Иммунитет, методы его выявления.

4.Специфическая профилактика и терапия дифтерии.

5.Микробиологическая диагностика дифтерии.

6.Бордетеллы-возбудители коклюша, свойства. Факторы патогенности. Патогенез коклюша. 7.Лабораторная диагностика коклюша.

8.Терапия и специфическая профилактика коклюша.

Дифтерийная палочка – возбудители дифтерии.

Дифтерия – острое инфекционное заболевание, характеризующееся токсическим поражением сердечно-сосудистой и нервной систем, а также специфическим фибринозным (дифтеритическим) воспалением в месте входных ворот.

Возбудитель был открыт в 1883 г. Клебсом, в 1884 г. Ф. Леффлер выделил его в чистой культуре.

В1888 г. Ру и Йерсен получили дифтерийный токсин, а в 1895 г. Беринг и Ру независимо друг от друга получили противодифтерийную сыворотку. В 1923 г. Рамон разработали технологию получения дифтерийного анатоксина, а позднее получил противодифтерийную сыворотку. Н.Г. Габричевский применил противодифтерийную сыворотку с лечебной целью и организовал ее производство в России.

Таксономия.

Род – Corynebacterium

Вид – С. diphtheriae

Врод Corynebacterium входят около 60 видов. Согласно Международной классификации Берджи этот род разделен на 3 секции:

1)патогенные для человека и животных;

2)патогенные для растений;

3)непатогенные.

Морфология.

Прямые или слегка изогнутые палочки размером 0,3 - 0,6 х 4 - 8 мкм, спор не образуют, имеют микрокапсулу, неподвижны.

Особенностями дифтерийной палочки является наличие булавовидных утолщениях на концах; палочки отличаются также полиморфизмом; характерно взаимного расположения бактерий в мазках – в виде цифр V,X,L (не полное расхождение при делении);

В толстых мазках располагаются в виде «пучка булавок». Булавовидные утолщения на концах связаны с наличием зерен волютина (тельца Бабеша-Эрнста) – производные нуклеиновых кислот, метахроматиновые гранулы полиметафосфата. Бактерии могут образовывать фильтрующиеся и L-формы.

Грамположительные микроорганизмы. При окраске по методу Нейссера тело клетки окрашивается в синий цвет, а зерна волютина - в желтый. Метод Леффлера окрашивает цитоплазму в голубой цвет, а зерна волютина – в темно-синий.

Культуральные свойства.

Возбудители дифтерии - факультативные анаэробы, отимальная температура их культивирования 37оС, рН 7,3-8,0. Требовательны к питательной среде, для роста необходимо наличие цистина, гистидина, фенилаланина, метионина и т.д.

Факторами роста являются Са2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Mn2+, Cu2+. Для культивирования применяют сывороточные (среда Леффлера), среды с добавлением крови, хинозальную среду Бучина. Дифференциально-диагностические среды: теллуритовая среда (Конради, Трох, 1913г.), глицериновокровяная среда с теллуритом (среда Клауберг ΙΙ), сывороточно-теллуритовый агар с цистином (Тиндаль), теллурит-шоколадный агар Маклеода.

На среде Леффлера бактерии растут в виде серовато-кремовых колоний, по типу «шагреневой кожи».

На теллуритовых средах возбудитель образует серовато-черные колонии, что обусловлено восстановлением теллурита до металлического теллура, имеющего черный цвет и аккумулирующегося бактериями.

Биохимическая активность.

Дифтерийные палочки малоактивны, сбраживают с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин, не разлагают сахарозу, лактозу, маннит, восстанавливают нитраты в нитриты. Не гидролизуют мочевину (проба Закса отрицательная), не образуют индол. Разлагают цистеин (проба Пизу положительная).

По культуральным, биохимическим, патогенетическим и некоторым другим свойствам дифтерийные палочки разделяются на 3 биовара.

1) биовар митис, характеризуется свойствами:

·ферментирует глюкозу, крахмал, мальтозу, не сбраживает сахарозу, гликоген, декстрин;

·обладает цистиназной активностью;

·восстанавливает нитраты;

·уреазная проба отрицательная;

·на средах с теллуритом образует мелкие гладкие блестящие черные колонии с ровным краем;

·на жидкой среде дает равномерное помутнение и порошкообразный осадок;

·дает зоны гемолиза на кровяных средах;

·малотоксичен;

·возбудители вызывают легкую спорадическую заболеваемость.

2) биовар гравис, характеризуется свойствами:

·ферментирует глюкозу, крахмал,декстрин, мальтозу,

·обладает цистиназной активностью;

·восстанавливает нитраты;

·уреазная проба отрицательная;

·на средах с теллуритом формирует крупные, сухие, матовые, плоские, серочерные колонии, приподнятые в центре, с радиальной исчерченностью и неровным краем (напоминают маргаритку);

·на жидкой среде образуется пленка, помутнение, крошковидный или крупнозернистый осадок;

·дает гемолиз на кровяных средах;

·обладает выраженными токсигенными свойствами;

·выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии, вызывает групповые вспышки.

3) биовар интермедиус, характеризуется свойствами:

·на средах с теллуритом образует мелкие сухие матовые серо-черные колонии с прозрачной периферией и неровным краем;

·на жидкой среде дает помутнение с последующим просветлением и образованием мелкозернистого осадка;

·гемолиз на кровяных средах отсутствует.

Антигенная структура.

Дифтерийная палочка имеет 2 антигена 1.О – антиген (групповой), полисахарид клеточной стенки, термостабильный, дает перекрестные реакции с микобактериями и нокардиями;

2.К – антиген (типовой), капсульный, термолабильный, иммуногенный, видоспецифичный.

На практике серотипирование не применяется, однако выпускаются диагностические сыворотки для РА, РПГА.

Для идентификации используют фаготипирование (22 фага) и бактериоцинотипирование (25 бактериоцинов).

Факторы патогенности.

Токсины. Палочка выделяет токсин – дифтерийный экзотоксин. По силе он занимает 3-е место после ботулинического и столбнячного. Термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный, протективный, обладает анестезирующим действием. Гистотоксин обладает дермонекротическими, гемолитическими свойствами. Синтезируется в виде неактивного предшественника - единой полипептидной цепи с молекулярной массой 61 кД. Активируется под действием собственной протеазы, которая разрезает полипептид на 2 связанные между собой дисульфидными связями пептида: А (21 кД) и В (39 кД). Пептид выполняет акцепторную функцию

– распознает рецептор, связывается с ним, формирует внутримембранный канал, через который проникает в клетку пептид А. Пептид А – это фермент, который обеспечивает перенос аденозиндифосфатрибозы из НАД на один из аминокислотных остатков (гистидина) белкового фактора элонгации EF-2. В результате модификации EF-2 утрачивает свою активность, что приводит к подавлению синтеза белка рибосомами на стадии транслокации. Токсин синтезируют только С. diphtheriae, лизогенные умеренным конвертирующим toxпрофагом, интегрирующимся с помощью сайт-специфической рекомбинации.

Оперон, кодирующий синтез токсина имеет промотор tox Р и 3 участка: tox S, tox А, tox В. Тox S – обеспечивает выход токсина через мембрану в периплазматическое пространство бактериальной клетки. Утрата клеткой профага или мутации в toxопероне делают клетку малотоксичной.

Ферменты патогенности: гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин, каталаза – факторы инвазии, лейкоцидин – обеспечивает устойчивость к фагоцитозу;

Структурные и химические компоненты клетки – пили (способствуют адгезии на чувствительных клетках), микрокапсула (обеспечивает устойчивость к фагоцитозу), корд-фактор (6-6-дифосфоэфир трегалозы, коринемиколовая и коринемиколиновая кислоты, обладающие

нарушает фосфорилирование в митохондриях), бактериоцины (корицины) кодирование синтеза которых передается плазмидами.

Резистентность.

При нагревании до 60оС палочки погибают за 10 мин, при 100оС наступает мгновенная гибель. 5% раствор карболовой кислоты обеспечивает инактивацию через – 1 мин. Под действием прямого солнечного света палочка выживает несколько часов, в высохших пленках и кале – 3-4 мес., на предметах обихода и одежде сохраняется до 15 дней, на мягких игрушках – 3 мес., в воде и молоке

– до 20 дней, в пыли – до 5 мес. Дифтерийные палочки чувствительны к пенициллину, тетрациклину, эритромицину.

Эпидемиология.

Источник инфекции – больной человек, носитель или реконвалесцент. Механизмы передачи инфекции:

–аэрогенный (пути - воздушно-капельный и воздушно-пылевой);

–контактный (путь - непрямой контактный).

Больной опасен (в смысле заражения) с последних дней инкубационного периода.

Входные ворота – слизистые оболочки носа, зева, гортани, трахеи, бронхов, конъюнктивы глаз, наружных половых органов; раневая поверхность, пупочная рана.

Инкубационный период – 2-14-20 дней.

Патогенез.

Возбудители адсорбируются на чувствительных клетках, колонизируют эпителий. Секретируют гистотоксин, который инициирует развитие местного фибринозного воспаления, некроз эпителия, паретическое расширение сосудов с нарушением их проницаемости, отек тканей и выход фибриногена из сосудов. Фибриноген под влиянием тканевого тромбопластина, некротизированных тканей и атмосферным кислородом свертывается. На поверхности образуется фибринозная пленка. На многослойном плоском эпителии - плотная, спаянная с прилежащими тканями; на однослойном – тонкая, легко снимается. Разрастание пленок в воздухоносных путях может привести к асфиксии (истинный круп). Процесс сопровождают регионарные лимфадениты. Системное действие токсина приводит к гемодинамическим нарушениям. Развивается токсический миокардит и ранний паралич сердца. Возможно поражение канальцевого аппарата почек, некроз коркового слоя. В нервной системе – цитолиз нервных клеток

сразвитием поздних параличей мягкого неба, диафрагмы, сердца, блуждающего нерва. Смерть при дифтерии может наступить от раннего или позднего паралича сердца и диафрагмы, а также в результате истинного крупа (закупорки дыхательных путей оторвавшимися пленками).

У детей грудного возраста чаще развивается дифтерия зева (насмокр, слабая выраженность общих проявлений). Необходимо осматривать пупочную ранку для исключения местного процесса.

Иммунитет.

После перенесенного заболевания развивается стойкий напряженный антитоксический и мало выраженный антимикробный иммунитет. Возможно развитие носительства (10%) и повторное заражение (6-8%). Уровень иммунитета можно установить в РПГА. Диагностические – титры - 1:200 и выше. С той же целью применяется реакция Шика – внутрикожное введение микродоз дифтерийного токсина (1/40 Dlm 0,2 мл) внутрикожно. Через 48 ч появляется покраснение и инфильтрат, что свидетельствует об отсутствии антитоксических антител; при их наличии реакция не возникает. Из-за опасности сенсибилизации организма эту пробу проводят редко.

Микробиологическая диагностика.

Исследуемый материал – слизь из зева, носа, пленки с миндалин, раневое отделяемое, кровь

1.Бактериоскопический метод – микроскопия мазков из исследуемого материала (окраска по Граму, Нейссеру, Леффлеру).

2.Бактериологический метод – выделение чистой культуры возбудителя и ее идентификация. Необходимо не только выделить из исследуемого материала дифтерийную палочку, но и определить ее токсигенность.

Определение токсигенности С. diphtheria:

а) биологическая проба на животных – внутрикожное заражение морских свинок фильтратом культуры дифтерийных бактерий – вызывает некроз в месте введения.

Минимальная смертельная доза (20-30 нг) убивает морскую свинку на 4-5 день; б) заражение куриных эмбрионов (наблюдается гибель под действием токсина); в) внесение в культуру клеток (выявление ЦПД); г) метод твердофазного ИФА с меченными пероксидазой антителами;

д) использование ДНК-зонда для обнаружения tox-оперона в геноме;

е) тест Илека и Оухтерлони (1948 г.) – основу составляет способность токсина и антитоксина диффундировать в агар и образовывать преципитаты (усы, стрелы) по ходу диффузии – метод двойной преципитации в геле, предварительный ответ может быть выдан через 48 часов, через 72 часа – заключение о наличии токсигенных коринебактерий, через 96 часов – окончательный ответ.

3.Серодиагностика – РПГА, ИФА, РИА, реакция ко-агглютинации, реакция Шика. 4.Экспресс – диагностика – РИФ, ИФА, РПГА, реакция ко-агглютинации.

5.Биохимический и молекулярно-биологический метод – ПЦР (обнаружение toxгена).

Специфическая профилактика.

Проводится плановая вакцинация в соответствии с национальным календарем прививок. Вакцинами АКДС, АКДС-М, анатоксинами: АДС, АДС-М, АД-М, АД.

Вакцинация проводится в возрасте: 3 месяца; 4,5 месяцев; 6 месяцев; первая ревакцинация проводится через 18 месяцев после окончания вакцинации; вторая ревакцинация – в 7 лет; третья

– в 14. Последующие ревакцинации - каждые 10 лет до 56 лет.

Существует еще ряд вакцин для профилактики дифтерии: «Тетракок», «Д. Т. Вакс», «Имовакс Д.Т. Адюльт», «Бубо-М», «Тританрикс НВ».

Неспецифическая профилактика – изоляция больного, выявление носителя (носителей токсигенных штаммов госпитализируют, нетоксигенных – санируют амбулаторно).

Лечение.

Введение противодифтерийной антитоксической сыворотки, содержащей не менее 2000 МЕ в 1 мл. Внутримышечное введение в дозе 10000-400000 МЕ в зависимости от тяжести течения заболевания. При применении лошадиной сыворотки обязательно предварительное проведение кожной пробы и последующее введение противодифтерийной сыворотки по Безредке.

Неспецифическая терапия – антибиотики и сульфаниламиды.

Коклюшная палочка – возбудитель коклюша.

Коклюш – это острое инфекционное заболевание, характеризующееся острым катаральным воспалением верхних дыхательных путей и приступами спазматического кашля.

История открытия.

Возбудитель коклюша впервые выделили от больного ребенка Ж. Борде и О. Жангу в 1900 г., в 1906 г. была получена чистая культура. Коклюш с французского переводится как пение петуха. 1911 г. Н. Ферри открыла В. bronchiseptica. В 1937 Г.Эльдеринг и П. Кендрик – выделили и изучили В. parapertussis независимо от У. Брэнфорда и Б. Славина.

Таксономия.

Род – Bordetella

Виды Bord. Pertussis; Bord. Parapertussis; Bord. Bronchiseptica.

Морфология.

Палочки овоидной формы, мелкие, неподвижные, Bord. bronchiseptica – перитрих, спор не образуют, имеют нежную капсулу. Выявляется при окраске по методу Романовского – Гимзы. Грамотрицательные.

Культуральные свойства.

Bord. Pertussis – строгие аэробы; требовательны к питательным средам, не растут на МПА, так как рост ингибируется жирными кислотами, для их нейтрализации в среде добавляют кровь, древесный уголь или ионообменные смолы. Bord. bronchiseptica и Bord. parapertussis растут на МПА. Bord. pertussis – гемоглобильнофильный микроорганизм, поэтому хорошо растет на картофельно глицериновом агаре с кровью (среда Борде-Жангу), полусинтетическом – казеиновоугольном агаре без крови (КУА). Быстрый рост (через 2 суток) отмечается у Bord. parapertussis и Bord. bronchiseptica, а колонии Bord. pertussis появляются через 72 часа – мелкие, круглые с ровными краями, блестящие напоминают «капельки ртути» или «зерна жемчуга», вязкой консистенции. Рассматривают их с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа. Выявляются колонии с характерным световым конусом. Через 3-4 суток культивирования на кровяном агаре появляется слабая зона гемолиза. В жидких средах образуют равномерное помутнение с последующим выпадением осадка. Оптимальные условия роста: температура 35 - 36оС, рН 6,8-7,4.

При культивировании коклюшной палочки различают 4 фазы состояния с определенными морфологическими и биологическими свойствами:

1фаза (S-форма) – колонии круглые, выпуклые, влажные, Гр -, вырастаютовоидные палочки;

2и 3 фазы – переходные к R-формам, колонии плоские, слизистые с желтоватымоттенком, определяется полиморфизм микроорганизма – овоидные и кокки;

4фаза – колонии уплотнены с желтым или зеленым пигментом, крупные, до 3 мм.

Биохимическая активность.

Хемоорганотрофы. Малоактивны, особенно коклюшные палочки: не ферментируют сахара, не образуют индол, не восстанавливает нитраты (за исключением Bord. bronchiseptica), не содержат тирозиназу и уреазу.

Паракоклюшная палочка разлагает тирозин, при этом среда окрашивается в коричневый цвет, и мочевину (проба Закса положительная).

Антигенная структура.

О-антиген – видоспецифический. Выявлено 14 антигенных компонента. Родовой – 7

фактор.Видовые: 1 - Bord. pertussis; 14 - Bord. parapertussis; 12 - Bord. bronchiseptica.

Типоспецифические антигены Bord. pertussis – 2,3,4,5, 6, 13 (наиболее часто встречаются серовары 1,2; 1,3; 1,2,3); у Bord. parapertussis – 8,9,10. Bord. bronchiseptica – 8, 9, 10, 11, 13.

Факторы патогенности.

Токсины. Возбудители синтезируют несколько токсинов.

1.Экзотоксин – термолабильный белок (инактивируется при 56оС), дермонекротоксин, протективный антиген, обладает тропизмом к нервной, сердечно-сосудистой системе. При введении мышам вызывает некроз, геморрагии и дегенерацию клеток почек, селезенки и печени. Токсин воздействует на систему цАМФ. Представлен двумя субъединицами – А (активный центр) и В (связывающий центр). Взаимодействие с клеточной стенкой происходит при помощи субъединицы В, опосредующей контакт субъединицы А с цитоплазмой. Токсин отщепляет

никотинамид от никотинамидаденозина, что приводит к повышению концентрации цАМФ и ингибированию активности клеточных факторов резистентности.

2.Цитотоксин вызывает местные поражения, приводящие к гибели и десквамации мерцательного эпителия. Токсин небелковой природы и является продуктом синтеза и трансформации муреина. 3.Гистаминсенсибилизирующий фактор (эндотоксин) – белок, вызывает сенсибилизацию к гистамину.

4.Лимфоцитозстимулирующий фактор – вызывает гипогликемию и снижение иммунологической реактивности.

Ферменты патогенности: лецитиназа, плазмокоагулаза, гиалуронидаза, лецитиназа.

Клеточные структуры – капсула, ворсинки.

Резистентность.

Возбудитель малоустойчив во внешней среде, чувствителен к высушиванию, погибает при действии солнечного света в течение - 1 часа, при температуре 56оС – через 10-30 мин, в 3% растворе фенола и лизола – через несколько минут. При высыхании мокроты гибнет в течении нескольких часов. Чувствителен к антибиотикам – тетрациклину, стрептомицину, левомицетину.

Эпидемиология.

Источник инфекции – больные люди, реже бактерионосители. Источником Bord. bronchiseptica могут быть больные животные (возбудитель вызывает эпизоотии у свиней, собак, кошек, кроликов). Больные наиболее опасны в начальный период заболевания (заразный период при коклюше до 4-х недель, при паракоклюше - 2 недели).

Механизм заражения - аэрогенный, пути - воздушно-капельный и контактнобытовой. Следует отметить высокий индекс контагиозности – 97-100%, чаще болеют дети до 5 лет.

Патогенез.

Возбудитель обладает тропизмом к цилиндрическому эпителию респираторного тракта. Инкубационный период 3 – 14 дней. Микроорганизм внедряется на слизистые, размножается, бронхогенным путем распространяется в бронхиолы и альвеолы. Возникает катаральное воспаление. Возбудитель выделяет токсины, под их действием эпителий некротизируется, кашлевые рецепторы перераздражаются, организм сенсибилизируется. Раздражаются рецепторы кашлевой рефлексогенной зоны «невроз респираторного тракта», в ЦНС (кашлевой центр продолговатого мозга) формируется доминантный очаг возбуждения, что вызывает приступообразный кашель. Судорожные приступы кащля могут провоцироваться неспецифическими раздражителями (звук, пыль). Бактериемии, как правило, не бывает.

Различают клинические периоды:

1)катаральный (2 недели); характеризуется сухим кашлем, состояние постепенно ухудшается; 2)конвульсивный (судорожный) (4-6 недель) отмечаются приступы спастического кашля (до 20-30 раз в сутки). Во время приступа ребенок не может вдохнуть воздух; наблюдается серия из 5-10-15 кашлевых толчков (выдохов), после чего следует свистящий вдох (реприз, или «пение петуха»); 3)период угасания – 2-4 недели – приступы наблюдаются все реже, происходит отторжение некротизированных участков слизистой оболочки верхних дыхательных путей в виде слепков. Смерть может наступить в результате асфиксии, пневмонии, в редких случаяхот спонтанного пневмоторакса.

У детей раннего возраста репризы не выражены, а у привитых детей может быть атипичное течение заболевания. У грудных детей возможно развитие коклюшной пневмонии. Типичны разрывы и язвочки на уздечке языка.

В последние годы участились случаи заболевания у взрослых, протекающие без приступов кашля, в виде бронхитов с упорным кашлем, без повышения температуры.