3 курс / Фармакология / Фармацевтическая_технология_Том_2_НФаУ

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Источники азота. В бактериальных клетках азота до 12% в пересчете на сухую биомассу, в мицелиальных грибах - до 10%. Микроорганизмы могут ис­ пользовать как органические, так и неорганические источники азота. Известно, что бактерии более требовательны к источникам азота, чем большинство микромицетов, актиномицетов и дрожжей. При выращивании биомасс в концентрации 30-40 г/л потребность в добавках азотсодержащих солей обычно не превышает 0,3-0,4% от объема среды. В производственных питательных средах источника­ ми азота могут служить белки, пептиды, свободные аминокислоты. Чаще всего в промышленной ферментации используют кукурузный экстракт, соевую муку или гидролизаты дрожжей.

Из минеральных азотсодержащих веществ наиболее часто применяют аммониевые соли серной, соляной или азотной кислоты. Влияние источников азота на биосинтез зависит не только от самого источника азота, но и от общего состава среды. Существенное значение имеет соотношение азота и углерода в среде - определенное для каждого штамма-продуцента.

Источники фосфора. Фосфор является важным компонентом клетки. Он входит в состав нуклеиновых кислот, фосфолипидов и других важных компонен­ тов клетки. В качестве источника фосфора широко используются фосфаты аммо­ ния, которые получаются нейтрализацией фосфорной кислоты аммиаком. Чаще всего применяют аммофос, который представляет собой смесь моно- и диаммо­ нийфосфатов, а также нерастворимых примесей (шлама). Аммофос является ис­ точником не только фосфора, но и азота. Ортофосфорная (фосфорная) кислота Н3РО4 также используется как источник фосфора и для подкисления среды.

Микроорганизмы нуждаются еще в 10 минеральных элементах, но в зна­ чительно меньших количествах. Повышенная потребность микроорганизмов в микроэлементах возникает, если целевой метаболит содержит микроэлемент. Так, при биосинтезе витамина В12 в состав питательной среды включают ко­ бальт; молибден и бор, которые стимулируют биосинтез тиамина в клетках клубеньковых бактерий; медь присутствует в ряде ферментов.

Другие виды сырья. Помимо основных компонентов питательных сред, в процессах ферментации нередко используют дополнительные виды сырья - предшественники, поверхностно-активные вещества (ПАВ), антибактериальные препараты и др.

Предшественники - синтетические продукты, входящие в состав молеку­ лы целевого продукта и добавляемые в ферментационную среду для интенси­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

фикации процесса биосинтеза. Например, при биосинтезе пенициллина в куль­ туральную жидкость добавляют в качестве предшественника фенилуксусную кислоту или фенилацетамид, при биосинтезе эритромицина - пропиловый спирт, витамина В12 - 5,6 диметилбензимидазол.

Поверхностно-активные вещества в биологических производствах ис­ пользуют главным образом для пеногашения.

Антибактериальные препараты (фурадонин, фурациллин) иногда добав­ ляют в культуральную жидкость в небольших количествах для поддержания асептических условий.

Флокулянты. В некоторых биотехнологических производствах целесооб­ разно стимулировать флокуляцию (конгломерацию) клеток продуцента, напри­ мер, для более эффективного фракционирования клеток или с целью удержива­ ния клеток в условиях непрерывной ферментации. Для этого применяют хими­ ческие флокулянты (хлорид кальция, соли фосфорной кислоты) или синтетиче­ ские полиэлектролиты, которые могут быть анионили катионактивные или неионогенные. На выпадающем в осадок фосфате кальция, например, адсорби­ руются клетки продуцента. Из анионактивных полиэлектролитов используют сополимер акриламида и натриевой соли акриловой кислоты. Катионактивные полиэлектролиты осаждают белковые вещества ферментируемой среды и на них адсорбируются клетки.

Технология приготовления питательных сред. Каждый конкретный микробиологический процесс имеет свои особенности на стадии приготовления питательных сред, что связано с применяемым в данном производстве источни­ ком углерода. На рис. 14.2 приведена общая схема приготовления питательной среды.

Растворимые источники углерода (например, сахара) предварительно растворяют в воде, доводя растворы до определенной концентрации в неболь­ ших открытых реакторах с мешалками, а затем подают в закрытый реактор­ смеситель с плоским дном, снабженным для ввода пара барботажным устрой­ ством. Нерастворимые источники углерода тщательно суспендируют в воде в реакторе с мешалкой и переводят суспензию в реактор-смеситель. Крахмалсо­ держащее сырье предварительно клейстеризуют.

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

сред используют два метода: при периодическом культивировании - цикличе­ ский и при непрерывном культивировании - непрерывный.

Циклический метод стерилизации питательной среды очень прост. Эту операцию можно осуществить непосредственно в ферментаторе. При этом сре­ да и оборудование стерилизуются одновременно. Чаще всего используют ком­ бинированный нагрев острым и глухим паром. Острый пар подают в питатель­ ную среду, а глухой - в рубашку (или в змеевик). Острый пар поступает в фер­ ментатор через штуцеры для подачи посевного материала, воздуха и для взятия проб. Поэтому вся арматура, соединенная с ферментатором, стерилизуется про­ ходящим острым паром.

При циклической стерилизации поддерживают температуру 121 °С, что соответствует давлению насыщенного пара 100 кПа. Обычно питательные сре­ ды выдерживают при такой температуре от 30 до 40 мин. Полный цикл нагре­ вания, выдержки и охлаждения для ферментаторов большого объема достигает нескольких часов.

Длительная тепловая стерилизация приводит к определенным химиче­ ским изменениям в составе питательной среды. Некоторые нестойкие к нагре­ ванию соединения разлагаются, что приводит к потере необходимых для мик­ роорганизмов питательных веществ. Другие соединения могут вступать во взаимодействие между собой с образованием продуктов, ингибирующих рост микроорганизмов. Большинство изменений химических компонентов в составе питательной среды может происходить при температурах, более высоких, чем температура стерилизации. Следовательно, эффективная стерилизация при ми­ нимальном изменении состава среды может быть достигнута применением бо­ лее высокой температуры, быстрым нагреванием и охлаждением среды. Поэто­ му в настоящее время циклический метод применяют для стерилизации среды только в аппаратах малого объема.

Метод высокотемпературной непрерывной стерилизации, используемый на большинстве заводов, дает возможность свести к минимуму ухудшение пи­ тательных качеств среды без снижения эффективности самой стерилизации.

Приготовленная в отдельной емкости питательная среда насосом прока­ чивается через установку непрерывной стерилизации в заранее простерилизо­ ванный ферментатор. На рис. 14. 3 представлена схема непрерывной стерили­ зации в потоке.

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

На первом этапе идет интенсивное размножение культуры. Она проходит через все характерные фазы развития. На этом этапе компоненты питательной среды используются, главным образом, на получение энергии и конструктив­ ный обмен веществ - происходит постепенная ассимиляция источников угле­ рода и азотсодержащих веществ, в среде накапливаются продукты окисления углеводов, например, кислоты. На втором этапе происходит интенсивный син­ тез нужного метаболита (иногда он идет параллельно процессу роста культу­ ры), наблюдается старение клеток и их автолиз.

Ферментацию прекращают, когда в среде накапливается максимальное ко­ личество полезного продукта. Конец ферментации можно определить и микро­ биологически по морфологическим изменениям клеток продуцента. Окончив ферментацию, культуральную жидкость охлаждают до 10-15° С и перекачивают в резервуары, из которых она постепенно подается на дальнейшую обработку.

Оборудование для реализации процесса ферментации

Ферментаторы представляют собой герметические цилиндрические емко­ сти, объемом от 50 л до 200 м . Высота ферментаторов в 2-2,5 раза превышает диаметр. Чаще всего их изготавливают из нержавеющей стали. В ферментато­ рах установлены мешалки турбинного, пропеллерного или другого типа. Диа­ метр турбины составляет 1/3 диаметра аппарата. В производстве антибиотиков широко распространены ферментаторы с мешалками, под которыми находится кольцевидный или радиальный воздушный барботер. Для поддержания темпе­ ратуры в аппарате имеется двойной кожух или теплообменник типа змеевика. Ферментатор оборудован арматурой и трубопроводами для подачи питательной среды, воды, пара, раствора, регулирующего рН, пеногасителей, воздуха и дру­ гих материалов. Современные ферментаторы укомплектованы измерительными приборами и регулирующими устройствами. Ферментаторы оборудованы уст­ ройствами для пеногашения и смотровыми люками.

Главное требование к аппаратам - это сохранение стерильности, поэтому они должны быть герметичными. Все линии трубопроводов должны быть дос­ тупны для обработки горячим паром.

В связи с интенсивной аэрацией и перемешиванием во время фермента­ ции питательная среда образует пену. Это может нарушить стерильность про­ цесса и вызвать потери культуральной жидкости. Для ограничения пенообразо­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

вания используют как химические средства (масло, олеиновая кислота, силико­ ны и др.), так и механические (вращающиеся лопасти в верхней части аппарата, циклоны, струи жидкости и др.). Существуют методы и устройства химико­ механического пеногашения.

Конструкции ферментаторов различны. Рабочий объем не превышает 7/10 общего объема. Свободное пространство над поверхностью раствора ис­ пользуется как буферное, где накапливается пена и таким образом предотвра­ щается потеря культуральной жидкости. Исследования показали, что в пеня­ щейся жидкости условия аэрации лучше, чем в плотных растворах, при условии непрерывного перемешивания и циркуляции слоя пены, т.е. при исключении длительного нахождения микроорганизмов вне культуральной жидкости.

К ферментаторам, как главным аппаратам микробиологического синтеза, предъявляются самые высокие требования. Важно иметь полную информацию о ходе процесса, поэтому в ферментаторы вмонтированы приборы - измерите­ ли и регуляторы всевозможных параметров. Современный процесс фермента­ ции управляется автоматически по заданной программе с центрального пульта.

Число используемых процессов микробиологического синтеза достаточно велико. В зависимости от вида процесса, применяемых сырья и культуры мик­ роорганизмов различаются и требования к аппарату.

1. Установки для поверхностного культивирования микроорганизмов.

При производстве ферментов и органических кислот до сих пор широко применяется культивирование микроорганизмов на поверхности жидких или сыпучих сред. Культивирование микроорганизмов на сыпучих средах (твердо­ фазная ферментация) при производстве ферментов осуществляется в кюветах, а также в различных механизированных установках. Схема одной из современ­ ных установок конструкции ВНИИ биотехника для культивирования в слое сы­ пучего сырья высотой 300—500 мм изображена на рис. 14.4.

Аппарат представляет собой вертикальный сосуд цилиндрической формы с коническим днищем, снабженный рубашкой и змеевиками для охлаждения культуры. Внутреннее пространство разделено на несколько секций горизон­ тальными перфорированными пластинами. Субстрат перемешивается с помо­ щью лопастных мешалок, установленных в каждой секции на вертикальном ва­ лу. Засеянную питательную среду загружают через верхний люк, а готовую культуру выгружают через нижний люк. Культура подается с верхних секций на нижние путем периодического переворачивания перфорированных пластин