Этапы
Получение изолированного гена
Перенос вектора с геном в модифицируемую клетку
Непосредственно редактирование и отбор генетически модифицированных клеток
Thomas Gaj,Charles A. Gersbach,Carlos F. Barbas (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 31(7), 397—405,
Доставка
Трансфекция |
Трансдукция |
(невирусные |
(вирусные векторы) |
средства) |
|
Липосомы |
Лентивирусы и |
|
ретровирусы |
Электропорация |
Аденовирусы |
Генная пушка |
AAV и scAAV |
Huang, S (2013). “Development of hybrid viral vectors for gene therapy”. Biotechnology Advances. 31 (2): 208—23.
Трансфекция
Choi Ysб, Lee MY, David AE, Park YS, Nanoparticles for gene delivery: therapeutic and toxic effects, Mol Cell Toxicol. 2014; 10: 1-8
Трансдукция
Colella P, Ronzitti G, Mingozzi F. Emerging Issues in AAV-Mediated In Vivo Gene Therapy. Molecular therapy. Methods & Clinical Development. 2018 Mar;8:87-104. DOI: 10.1016/j.omtm.2017.11.007.
Общие принципы
редактирования
Система редактирования генома состоит из ДНК- распознающего домена и эндонуклеазы
ДНК-распознающий домен связывается с нуклеотидной последовательностью
Нуклеаза осуществляет двухцепочечный разрыв
В дальнейшем происходит гомологичная репарация (HDR, используется для добавления или замены), либо негомологичная (NHEJ, для knock-out)
CRISPR/Cas9
Изначально механизм защиты бактерий (в частности Streptococcus pyogenes) от бактериофагов
В собранном виде состоит из одноцепочечной гидовой РНК (sgRNA) и нуклеазы II типа (Cas9)
Принцип работы CRISPR/Cas9
Этапы:
•Приобретение генетически чужеродных последовательностей
•Транскрипция и образование комплекса CRISPR-Cas9
• Интерференция
Принцип работы CRISPR/Cas9
•Сборка CRISPR-Cas системы на основе генов в CRISPR-локусе
•sgRNA распознает комплементарный участок ДНК и связывается с ним
Принцип работы CRISPR/Cas9
Cas9 осуществляет двухцепочечный разрыв неподалеку от PAM (protospacer adjacent motif, чаще всего NGG)
Гомологичная рекомбинация на основе «нормальной» последовательности или негомологичное «сшивание» концов
CRISPR/Cas9 в терапии рака
PD-1 (Programmed cell death protein 1, CD279) – рецептор, подавляющий активность T- лимфоцитов при связывании с лигандом PD- L1 и играющий ключевую роль в развитии рака легких.
•Лимфоциты пациента собираются
•Трансфекция плазмид CRISPR и Cas9 с помощью электропорации
•Knock-out гена PD-1
•Культивация лимфоцитов без экспрессии PD-1
•Реинфузия