Пример клонирования днк[править | править вики-текст]

Рис. 2. Взаимодействие плазмиды с чужеродной ДНК

В качестве примера рассмотрим процесс клонированияучастка чужероднойДНКбактериейE. coliпри помощиплазмидыpBR322^[1].

pBR322— искусственная плазмида, созданная Франциско Боливаром и Раймондом Родригесом с целью клонирования генетического материала. Она представляет собой циклический фрагмент ДНК длиной 4361нуклеотидныхпары (рис. 1). Плазмида содержитгенустойчивости ктетрациклинуtet, взятый из естественной плазмиды pSC 101; ген устойчивости кампициллинуamp, взятый изтранспозонаTn3; и участок началарепликацииori, заимствованный из плазмиды pMB 1. Тетрациклин и ампициллин — сильныеантибиотики. Наличие в плазмиде генов устойчивости к ним (активных или блокированных) играет существенную роль в выделении бактерий со встроенным участком чужеродной ДНК. Плазмида содержит такжесайты рестрикцииPst I,BamHI иSalI, причём первый находится в гене amp, а два остальных — в гене tet. Это важное обстоятельство помогает модифицировать плазмиду.

Предположим, что в плазмиду необходимо встроить фрагмент, который ранее был вырезан из другой ДНК рестриктазойBamHI (то есть он имеет на концах последовательность нуклеотидов, характерную для сайта рестрикцииBamHI). Для этого плазмиды обрабатываются рестриктазойBamHI, (которая разрежет кольцевую молекулу в сайте рестрикции и образует линейный участок ДНК) и добавляются участки чужеродной ДНК. Поскольку на концах всех фрагментов ДНК находятся комплементарные последовательности нуклеотидов, они начнут «склеиваться», причём возможны два варианта склейки (рис. 2) :

• Соединятся концы линейной плазмиды pBR 322, образовав исходную (восстановленную) кольцевую плазмиду.

• Между концами линейной плазмиды pBR 322 вклинится участок чужеродной ДНК, образовав кольцевую плазмиду со встроенным фрагментом.

Поскольку плазмиды со встроенным фрагментом являются целью процесса, необходимо выделить такие плазмиды и клонировать их. Процесс идёт следующим образом:

1. Плазмиды внедряются в клетки E. coli. Для этого клетки обрабатываютсяионамиCa²⁺, что делает ихмембраныпроницаемыми для ДНК.

2. Полученные бактерии высевают на среду, содержащую ампициллин. В этой среде нормально растут колонии бактерий, содержащие плазмиды, остальные колонии угнетаются. По этому признаку можно отличить бактерии, содержащие плазмиды;

3. Колонии, содержащие плазмиды, перепечатываются на среду, содержащую тетрациклин. Поскольку чужеродная ДНК вклинивается внутрь гена tet, дезактивируя его, колонии бактерий с модифицированными плазмидами угнетаются тетрациклином. Таким образом они визуально отличимы от колоний бактерий с восстановленными плазмидами.

4. В результате этих действий выделяются колонии E. coli, в плазмиды которых встроен участок чужеродной ДНК. Они высеваются в обычную среду для дальнейшего клонирования.

Процедуру клонирования можно также вести с помощью рестриктаз SalI иPstI. В первом случае процесс будет аналогичен, в последнем бактерии с модифицированными плазмидами будут, наоброт, чувствительны к ампициллину и нечувствительны к тетрациклину.

50) что такое дидезоксинуклеотиды

дидезоксинуклеотид - (Сокр. didN). Синтетический дезоксинуклеотид, у которого нет гидроксильной группы в 3 положении и поэтому потеряна способность формировать фосфодиэфирную связь 3 + 5, необходимую для удлинения (элонгации) цепи. Используется в реакции секвенирования ДНК по методу Сэнгера в качестве специфичного терминатора синтеза цепи и для лечения некоторых вирусных заболеваний

Перейти к: навигация,поиск

Секвенирование биополимеров(белковинуклеиновых кислот—ДНКиРНК) — определение их аминокислотной илинуклеотиднойпоследовательности (отлат.sequentum— последовательность). В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов (next-generation sequencing) и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК, получают последовательности участков генов, целыхгенов, тотальноймРНКи даже полныхгеномоворганизмов^[1][2].

Для секвенирования применяют методы Эдмана,Сэнгераи другие; в настоящее время для секвенирования генов обычно применяютметод Сэнгерас дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP). Обычно до начала секвенирования производятамплификациюучастка ДНК, последовательность которого требуется определить, при помощиПЦР. Секвенирование полного генома обычно осуществляют при помощитехнологий секвенирования нового поколения(next-generation sequencing).