2.4. Біологічні особливості дріжджів

Дріжджі, що належать до роду Saccharomyces, становлять інтерес для генетичних досліджень, тому що є типовими еукаріотами. Водночас легко культивуються, мають високу швидкість розмноження, невелику кількість стадій у циклі розвитку і досить легко контрольовані в експерименті.

Вегетативна дріжджова клітина, як правило, диплоїдна. При утворенні аска в ній формується до чотирьох гаплоїдних спор.

Утворення диплоїда – важлива особливість життєвого циклу дріжджів, на підставі якої дріжджі підрозділяють на гомо- та ґетероталічні. У гетероталічних дріжджів (Saccharomyces) диплоїд утворюється в результаті копуляції гаплоїдних клітин, що належать до різних типів спарювання (позначуваних а і α). Отже, такі клітини або спори можуть копулювати тільки із клітинами й спорами комплементарного типу спарювання. Тип спарювання а або α визначається алелями одного гена.

При копуляції гаплоїдів або аскоспор різного типу спарювання утворюється гетерозиготний за цим геном диплоїд генотипу (аα) нейтральний у статевому відношенні. Якщо ізолювати одну з аскоспор будь-якого типу спарювання, то при

36

переміщенні на свіже поживне середовище вона почне розмножуватися й дасть гаплоїдний клон.

Варто відзначити, що дріжджі – ізогамні, і розходження у морфології клітин різних типів спарювання не спостерігається. Однак відомо, що гаплоїдні клітини дрібніші за диплоїдні, вони сферичної форми й при брунькуванні утворюють характерні грудки. Диплоїдні клітини овальної форми й менше комкуються при брунькуванні. Одночасно зазначені ознаки – наслідок не тільки плоїдности, а й генотипу культури.

Гомоталічні дріжджі схильні до самодиплоїдизації за рахунок злиття спор в будь-яких комбінаціях, сестриних гаплоїдних клітин або материнської клітини зі своєю брунькою.

На заняттях використовують гетероталічний штам дріжджів виду S. cerevisiae, що походить від ХІІ раси й характеризується стійкою як гаплоїдною, так і диплоїдною стадіями.

Одержання клонів дріжджів і збереження їхньої генетичної чистоти.

Вивчаючи генетику мікроорганізмів, звичайно досліджують не окремі клітини, а їхні чисті культури , під якими розуміють потомство одного виду мікроорганізмів. У разі пересівань для підтримки життєздатності чистих культур встановити зв'язок між "батьками" і "нащадками" неможливо, тому що неможливо визначити, які саме клітини розмножилися й дали цю накопичувальну культуру. Під час проведення генетичних досліджень встановлення таких зв'язків абсолютно необхідно й досягається тільки при клонуванні культури. Клон – це генетично однорідна культура, отримана в результаті безстатевого розмноження клітини, що містить одне ядро, за умови рівного розподілу генетичного матеріалу батьківської клітини, тобто мітозу.

Клон як група генетично однорідних родинних організмів є основною одиницею обліку у вивченні мінливості й спадковості мікроорганізмів. Через генетичну недовговічність клону введено поняття „штам”. Під ним розуміють клонову за походженням культуру, спадково відносно однорідну, характерні риси якої підтримуються добором за специфічними ознаками. Штам, на відміну від клону, може бути збережений під час розмноження як безстатево, так і статево. Ознаки, властиві клону, як правило зберігаються при пересіваннях і одержанні вторинних клонів (субклонів) у подібних умовах культивування. Однаковість ознак клону й субклону свідчить про стійке спадкування їх у ряді клітинних поколінь. Ряд клонових ознак використовують у генетичних дослідженнях як мітки, або маркери (наприклад, ауксотрофність, форма, розмір і колір колоній і т.д.). А також фізіологічні ознаки – стійкість до антибіотиків, отрут, випромінювання і т.д.

Знання методів клонування необхідно не тільки для проведення генетичних досліджень, а й для вирішення практичних завдань – збереження й підтримки певних властивостей колекційних штамів, мікроорганізмів. Особливо важливо для збереження виробничо-коштовних штамів – попередити генетичне виродження штамів у результаті зберігання й частих пересівань. Із цією метою слід не пересівати на свіже поживне середовище, а здійснювати розсів цих штамів для

37

відбору клонів, що мають батьківські властивості культур, і для вибракування спонтанних мутантів.

Завдання на виконання

1. Для одержання окремих клонів методом розсіву моноклітинної суспензії готують суспензію, для чого в чашку Петрі з пятидобовою культурою дріжджів (засіяною суцільним газоном) додають 7 мл дистильованої води. Культуру змивають шпателем. Суспензію дріжджів піпеткою місткістю 10 мл переносять у склянки для центрифугування.

2. Після зрівноважування склянок суспензію центрифугують протягом 5 хв при обертовій частоті 1000 об/хв. З надосадової рідини спеціально підготовленою піпеткою місткістю 10 мл відбирають 3 мл і переносять у пробірку.

3. Відбирають дві петлі суспензії й переносять у камеру Горяєва. Підраховують кількість клітин і визначають концентрацію культури за формулою:

A = ₂₀ⁿ10⁶ ,

де n – сума клітин у п’яти великих квадратах.

4. Прийнятний режим центрифугування, коли у вихідній суспензії має міститися приблизно 10⁶ клітин/мл. Отриману в пробірці суспензію розводять приблизно в 100 разів. Кількість колоній після висіву не повинна перевищувати

500.

4. Для розведення беруть дві пробірки з 4,5 мл стерильної дистильованої води. У першу вносять 0,5 мл суспензії, потім з неї переносять 0,5 мл у другу. Із другої проводять розсів на щільне поживне середовище. У попередньо марковані чашки заливають поживне середовище. Після його застигання на поверхню наносять 0,05 мл суспензії. Потім стерильним шпателем розтирають суспензію по поверхні середовища. Чашки вміщують у термостат з температурою 30 °С. Схема проведення досліду зображена на рис. 2.1.

4. Переглянути під мікроскопом (збільшення 400 разів): вегетативні клітини гаплоїдного й диплоїдного штамів дріжджів; препарати „роздавлена крапля” у дистильованій воді. Визначити форму й розмір клітин (замалювати);

4. Висіяти диплоїдні й гаплоїдні штами на поживне середовище для споруляції; петлею зробити густий висів на поверхню середовища (приблизно 1 см²). Вирослу культуру розглядають на наступному занятті;

4. Приготувати у краплині води препарати з культур дріжджів з різною плоїдією; промікроскопіювати диплоїдні клітини, підрахувати кількість вегетативних клітин і асків у кількох полях зору, вивести відсоток споруляції; промікроскопіювати гаплоїдні культури, переконатися у відсутності споруляції; результати занести в табл. 2.1.

38

7 мл

ПА				Газон

Стерильна

Суспензія

Центрифугуванн
	я,
1 петля	3 мл надосадової
	2 петлі
2 мл
стерильної
води
1 петля	Камера Горяєва,
0,5 мл
	кількість, монотиповість

	4,5 мл
ПА,	стерильної
	води
Висів		0,05 мл
штрихом

ПА,

Титр

Рис.2.1. Схема виконання дослідів і виділення клонів (ПА – повне агаризоване середовище)

39

Таблиця 2.1

Морфологічні особливості диплоїдних і гаплоїдних культур дріжджів

№	Клітини		Тип	Кількість			Споруляція,
			розташування в
				Вегетативних
п/п	Форма	Розмір				Асків	%
			мазку	клітин
1
2
3
4
5
6

9. Для одержання окремих колоній виснажуючим штрихом у пробірку з 2 мл стерильні води вносять одну петлю дріжджової культури, ретельно перемішують. На твердому середовищі петлею проводять горизонтальний штрих суспензією з пробірки. Петлю обпалюють, охолоджують, проводять нею по поверхні середовища кілька вертикальних штрихів і знову обпалюють. Далі петлю охолоджують і проводять по поверхні середовища горизонтальні штрихи, що перетинають вертикальні, не торкаючи перший горизонтальний штрих. Розсів проводять на двох чашках.

Опрацювання результатів

Аналізи виконують після чотирьохдобового вирощування дріжджів у термостаті за температури 30°С. Визначити кількість вирослих колоній, визначити титр клітин шляхом підрахунку у камері Горяєва і методом висіву на агаризоване середовище, дослідити монотиповість і гетерогенність вирослих колоній візуально й за допомогою бінокулярної лупи (мікроскопа МБС-1). Результати занести у табл. 2.2.

							Таблиця 2.2
		Аналіз диплоїдних і гаплоїдних культур дріжджів
№	Штам		Характер	Титр клітин		Кількість колоній
				Камера
п/п			аналізу		Висів	монотипових	гетеротипових
				Горяєва
1
2
3
4
5
6

40

Контрольні запитання

1. Чому дріжджі Saccharomyces cerevisiae є важливим об’єктом біотехнологічних досліджень?

2. Охарактеризуйте морфологічні особливості гаплоїдних і диплоїдних клітин дріжджів.

3. Дайте характеристику метилотрофним дріжджам.

4. Яке практичне значення метилотрофних дріжджів?

5. Які переваги використання метилотрофних дріжджів у порівнянні з хлібопекарськими?

6. Які генетичні відмінності дріжджів і бактерій? У чому їх спільність?

7. Що означає поняття "гаплоїдна", "диплоїдна", "поліплоїдна" клітини?

8. Що означають поняття "штам", "клон", "асоціація"? Які їх спільні і відмінні ознаки?

9. В чому полягає суть методу клонування мікроорганізмів? Як його використовують у практичних цілях?

Література: [1, 2 6, 8,9].

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ 3

ОДЕРЖАННЯ ГІБРИДІВ І ПРИНЦИПИ ГІБРИДОЛОГІЧНОГО

АНАЛІЗУ

Мета: ознайомлення з методами схрещування клітин мікроорганізмів; виділення гібридів мікроорганізмів; одержання гібридних аскоспор і розсів отриманих аскоспор на чашки.

Обладнання та матеріали: термостат; чашки Петрі з мінімальним (М); повним (П); ацетатним середовищами (А); пробірки з 0,5 мл травного соку равликів (ТСР); 1 пробірка з 1 мл стерильної води; камера Горяєва; шпателя; стерильні піпетки; колба зі стерильною дистильованою водою; два штами дріжджів S. cerevisiae.

Загальні відомості 3.1. Схрещування клітин мікроорганізмів

На основі гібридизації мікроорганізмів можна, по-перше, з'ясувати характер успадкування тієї або іншої ознаки, що визначається ядром або цитоплазмою й залежить від одного або кількох генів і, по- друге, одержати гібриди з цінними для використання у виробництві батьківськими ознаками.

Методи одержання гібридів і вивчення розщеплення в їхньому потомстві визначається особливостями життєвого циклу досліджуваного організму. Гібридизація може здійснюватися як у гетероталічних, так і в гомоталічних організмів.

Для розшифрування структури генетичного апарата клітини аналізують розщеплення в потомстві гібридів за чітко наслідуваними ознаками (маркерами). Для виділення гібридних клітин використовують мікроманіпулятор або проводять

41

висів на спеціальні середовища, на яких селекціонують колонії гібридних клітин (за культуральними ознаками).

Якщо ознаку зумовлює один ген, у потомстві спостерігють розщеплення у відношенні 1:1 (АВ), що випливає із закономірної розбіжності гомологічних хромосом у мейозі, разом з якими розподіляються й алелі розглянутого гена. Якщо реєструють розщеплення за двома ознаками, причому кожна визначається одним геном і обоє вони розташовуються на різних парах хромосом, тобто незалежно комбінуються, то спостерігають розщеплення у відношенні 1:1:1:1 (якщо алелі одного гена позначити А і а, а іншого В і в), генотипи аналізованого гібрида Аавв і при мейозі 25 % аскоспор будуть мати генотип АВ, 25 % – Ав, 25 % – аВ і 25 % – ав. Якщо розщеплення за однією ознакою буде відрізнятися від АВ, це свідчить про те, що досліджувану ознаку визначають не один, а кілька генів.