- •ГЕНЕТИКА
- •Генетичне картування прокаріот ………….…….
- •Кількість ауксотрофних мутантів
- •Загальні відомості
- •Визначення концентрації життєздатних частинок бактеріофага Т4В
- •Література: [1, 2, 3, 4, 12].
- •Загальні відомості
- •Суспензія
- •1 петля
- •2 петлі
- •1 петля
- •Камера Горяєва,
- •Література: [2, 4, 6].
- •Розрахунок розведень вихідної суспензії клітин S. cerevisiae 15В-П4
- •після опромінення різними дозами УФ-променів (концентрація суспензії 5×106 клітин/мл)
- •4,9 мл води
- •0,9 мл води
- •0,9 мл води
- •0,9 мл води
- •КОНТРОЛЬ
- •ДОСЛІДИ
- •0,1 мл 0,5 М NaNO2
- •Витримка
- •Витримка
- •Витримка
- •0,1 мл 0,5 М NaNO2
- •0,1 мл 0,5 М NaNO2
- •Загальні відомості
- •Таблиця 5.1
- •Ростові фактори для ідентифікації біохімічних мутантів*
- •ПС + пептон
- •Контрольні запитання
- •Література: [1, 2, 5, 9].
- •Загальні відомості
- •ПА + стрептоміцин
- •Фосфатний буфер, 4,5 мл × 6× 3
- •Контрольні запитання
- •Література: [2, 3, 6, 9].
- •Нічна культура E. coli
- •Селективні середовища
- •Селективні середовища
- •Фосфатний буфер,
- •Колба, 50 мл
- •Фосфатний буфер,
- •Контрольні запитання
- •Література: [1, 2, 3, 8, 10, 11, 12].
- •Загальні відомості
- •Опрацювання результатів
- •Контрольні запитання
- •Література: [1, 2, 4, 5, 8, 11,12].
- •Рис.8.1. Виділення ДНК з Bacillus subtilis 23
- •Базова
- •Допоміжна
- •Осад ДНК
- •Осад ДНК
- •Осад очищеної ДНК
- •Віджати від спирту,
- •Розчин ДНК
- •Повторна депротеїнізація
- •та центрифугування, осадження 96 % і промивання 70 % етанолом
- •Розчин ДНК з РНКазою
50
|
|
|
Розрахунок розведень вихідної суспензії клітин S. cerevisiae 15В-П4 |
Таблиця 4.1 |
|||||
|
|
|
|
||||||
|
|
після опромінення різними дозами УФ-променів (концентрація суспензії 5×106 клітин/мл) |
|||||||
|
|
|
Передба- |
Густота висіву суспензії |
Розведення вихідної |
Рекомендовані розведення |
|||
|
Доза |
|
на чашки, клітин/мл |
суспензії |
|||||
№ |
|
чуване |
|
|
|||||
опромінення, |
|
|
|
|
|
|
|
||
Для обліку |
Для обліку |
Для обліку |
Для обліку |
|
Для обліку |
||||
п/п |
2 |
|
виживання, |
частоти |
частоти |
Для обліку виживання |
частоти |
||
|
ерг/мм |
|
% |
виживання |
виживання |
||||
|
|
|
мутацій |
мутацій |
|
мутацій |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
4,9 мл води + 0,1 мл |
|
1 |
Контроль |
|
100 |
104 |
105 |
у 500 разів |
у 50 разів |
суспензії (р. І) |
Висів з |
|
|
|
|
|
|
|
|
0,9 мл води + 0,1 мл |
р. І і р. ІІ |
|
|
|
|
|
|
|
|
з р. І (р. ІІ) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2,4 мл води + 0,1 мл |
|
2 |
1200 |
|
50 |
2·104 |
2·105 |
у 250 разів |
у 25 разів |
суспензії (р. І) |
Висів з |
|
|
|
|
|
|
|
|
0,9 мл води + 0,1 мл |
р. І і р. ІІ |
|
|
|
|
|
|
|
|
з р.І (р. ІІ) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1,6 мл води + 0,4 мл |
|
3 |
1800 |
|
10 |
105 |
105 |
у 50 разів |
у 5 разів |
суспензії (р. І) |
Висів з |
|
|
|
|
|
|
|
|
0,9 мл води + 0,1 мл |
р. І і р. ІІ |
|
|
|
|
|
|
|
|
з р. І (р. ІІ) |
|
|
|
|
|
|
|
|
Без роз- |
|
Висів без |
|
|
|
|
106 |
2·106 |
|
ведення по |
0,8 мл води + 0,2 мл |
|
4 |
2400 |
|
1 |
у 5 разів |
розведення |
||||
|
|
|
|
|
|
|
0,1 мл на |
суспензії (р. І) |
і з р. І |
|
|
|
|
|
|
|
чашку |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
51
Вихідна |
|
|
|
|
|
|
|
3,4 мл 0,5 мл |
|
|
|
КОНТРОЛЬ |
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
культура |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
дріжджів, |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
107 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,5 мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
клітин/мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2,9 мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
4,5 мл ф. б. 0,1 мл |
|
|
|
|
|
|
0,1 мл |
||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,1 мл 0,5 М NaNO2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
4,5 мл ф. б. |
|
|
|
|
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
0,1 мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
ДОСЛІДИ |
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
Витримка |
|
|
|
|
0,1 мл |
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,1 мл |
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
15 хв. |
|
|
|
0,9 мл ф. б. |
|
|
|
|
|
0,1 мл |
|||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||
|
2,9 мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
0,1 мл 0,5 М NaNO2 |
|
|
|
|
|
0,1 мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
0,9 мл ф. б. |
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
0,1 мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,9 мл ф. б. |
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
Витримка |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,1 мл |
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
30 хв. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,1 мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
0,1 мл |
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,1 мл 0,5 М NaNO2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
2,9 мл |
|
|
|
|
|
|
|
0,9 мл ф. б. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||
|
|
|
|
|
0,1 мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
0,9 мл ф. б. |
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
Витримка |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
45 хв. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,1 мл |
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,9 мл ф. б.
Рис.4.2. Схема оброблення клітинної суспензії дріжджів нітритом натрію (ф.б. – фосфатний буфер)
52
З кожного варіанта дослідів відбирають чашки з типовими колоніями для контролю і для кожної дози мутагену й підраховують кількість вирослих колоній (сумарно).
Обчислюють відсоток виживаності в кожній дозі мутагену для даного досліду з огляду на вихідні розведення для висівів; виживаність у контролі приймають за 100 %.
Опрацювання результатів
1. Позначимо число колоній, що виросли на трьох чашках у контролі, N, а число колоній, що виросли на трьох чашках при даній дозі – n. Для контрольних чашок здійснюють розведення вихідної суспензії в 500 разів, а опроміненої суспензії – лише в 250 разів, тобто кількість клітин, що потрапили на кожну чашку після опромінення, буде в два рази більшою. Позначимо коефіцієнт розведення контролю буквою k. Прийнявши виживаність клітин за 100 %, отримаємо виживаність при тій або іншій дозі:
|
|
n |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
100 |
|
= 100n , % |
||
S = |
|
k |
||||||
|
|
|
|
N |
||||
або для першої дози: |
|
|
|
|
kN |
|||
|
n |
|
|
|
|
|||
|
|
|
100 |
|
50n , % |
|||
S1 = |
|
2 |
= |
|||||
|
N |
|||||||
|
|
|
|
|
|
N |
Аналогічно розраховуємо виживаність і для інших доз мутагену.
Отримані дані щодо виживання клітин заносять у табл. 4.2 з урахуванням доз і кількості повторених дослідів, попередньо прологарифмувавши кожну величину виживаності:
xi = lg Si .
Обчислюють середнє значення виживаності для кожної дози за формулою:
|
|
|
x = |
∑xi |
, |
(1) |
|
|
|
|
|
n |
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Таблиця 4.2 |
|
Виживаність клітин дріжджів, оброблених мутагеном |
|||||||
|
|
Виживання опромінених клітин у |
Середнє |
|||||
№ |
Доза опромінення, с |
|
різних повторах, % |
|
значення |
|||
п/п |
(доза мутагену, хв) |
І |
ІІ |
ІІІ |
IV |
V |
логарифма |
|
|
|
виживання |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
160(15)
290(30)
3120(46)
Розраховують середнє квадратичне відхилення σ, погрішність середнього арифметичного mx за формулами:
|
|
|
|
|
|
|
|
53 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
mx = |
σ |
|
; |
(2) |
σ = |
∑(x −xi )2 |
. (3) |
|
|
|
|
n −1 |
|||||
|
n |
|||||||
|
|
|
|
|
|
довірчі mxt 95% |
||
Користуючись таблицею |
Стьюдента, |
визначають |
інтервали середніх значень, враховуючи, що при р повторних дослідах число ступеней свободи дорівнює р–1.
2.На міліметровому папері побудувати графік залежності виживаності опромінених клітин від дози УФ-променів або азотистої кислоти. На осі абсцис відкладають значення використаних у досліді доз мутагенів (в ергах на квадратний міліметр або в секундах), а по осі ординат – середні логарифми виживаності. На графіку вгору й униз від крапок, що відповідають середнім значенням виживаності для кожної із доз, відкладають довірчі інтервали, що показують розмах варіювання результатів у повторних дослідах.
3.Уважно розглянути вирослі на чашках колонії. Позначити тушшю всі мутантні клони, підрахувати їхню кількість і занести дані у табл. 4.3.
Таблиця 4.3
Частота аденозин-залежних мутацій у дріжджів S. cerevisiae 15В-ПЧ
|
Кількість |
Середня |
Загальна |
Кількість |
Частота |
|
Доза |
кількість |
кількість |
мутацій |
|||
переглянутих |
мутантних |
|||||
мутагену |
колоній на |
переглянутих |
аденозин- |
|||
чашок |
клонів |
|||||
|
чашці |
клонів |
залежності |
|||
|
|
|
||||
Контроль |
|
|
|
|
|
|
І |
|
|
|
|
|
|
ІІ |
|
|
|
|
|
|
ІІІ |
|
|
|
|
|
Середню кількість колоній на чашці визначають підрахунком колоній на чашках, засіяних для обліку виживаності. Частоту індукованих мутацій для кожної дози визначають за формулою:
C = MN ,
де М – кількість мутантних клонів; N – кількість колоній на переглянутих чашках. Частота появи спонтанних аденозинзалежних мутантів при такій вибірці
близька до нуля.
Всі дані з частоти індукованих мутацій за винятком спонтанного фону зводять у таблицю за повторними дослідами, як це було зроблено під час обліку виживаності. Розраховують середнє значення частот мутацій та їхні довірчі інтервали за формулами (2) і (3). Середню частоту індукованих мутацій обчислюють за формулою:
xc = ∑nxi ,
де xi значення частот мутацій, отримані в різних повторностях досліду для даної дози; n – кількість повторених дослідів.