Биохимия пособие Коновалова 2012

Главную роль в механизме окисления играет никотинамид (вит который может существовать в двух резонансных формах. В пер- Р'Г , орме избыточный (+) заряд у азота. В результате смещения элек- В ° о Н Н О Й плотности к N+ у атома углерода в пара-положении появляется Убыточный (+) заряд и свободная валентность. Такая частица называ­ йся карбкатион. К свободной валентности от окисляемого субстрата ггоисоединяется атом водорода (протон и электрон), а к положительно­ му заряду - электрон, т.е. молекула водорода в присутствии карбкатиона подвергаетсял'£тероаштическому.разрыт!уща гид(ЩД-ибН (Пр5тон и 2 электрона) и протон, Гидрид-ион присоединяется к НАД, а протон оста­

ется в матриксе митохондрий, подкисляя его.

Строение НАД - Н-никотинамид, А-аденин, Д-динуклеотид

Субстрат, отдав гидрид-ион НАД+ а протон в среду, окислился. НАЛ/ присоединив гидрид-ион, восстановился. Восстановленный НАД отщепляется от своего апофермента и подходит к внутренней мембране митохондрий, где окисляется вторым участником полной дыхательной цепи.

Если окисление субстрата происходило в цитозоле, образовавшийся НАДН попадает в митохондрии с помощью специальных челночных механизмов, т.к. мембраны митохондрий не проницаемы для НАДН.

111

Механизм окисления субстрата с участием НАД-зависимых дегидрогеназ

Н+ и2Е—

гидрид-ион

2. Окисление НАДН ФМН-зависимыми дегидрогеназами. ФМН-зависимые дегидрогеназы расположены во внутренней

мембране митохондрий. Это сложные ферменты, содержащие в качестве простатической группы ФМН и железосерные центры. Субстратом для них служит НАДН, поэтому по субстрату их называют НАДН-дегидрогеназы.

Строение ФМН (Ф-флавин, М-моно, Н-нуклеотид (флавин + рибитол - вит В2, рибофлавин)).

Главную роль в окислении НАДН играет изоаллоксазиновое кольцо флавина, где по месту разрыва двойных связей у атомов N в 1- ом и 10-ом положении могут присоединяться атомы водорода.

Механизм окисления НАДН НАДН-дегидрогеназой

112

цдДН, отдавая гидрид-ион на ФМН-зависимую дегидрогеназу, сляется, ФМН, присоединив гидрид-ион и протон из матрикса, °КИ(гганавливается. Окисленный НАД может присоединиться к ® л,ерменту НАД-зависимых дегидрогеназ и окислять новую молекулу ^бстрата. Железосерные центры, входящие в состав ФМН-зависимых С^гиДРогеназ’ благодаря способности Fe менять свою степень окисления ^ ре3+ на Fe2+, являются переносчиками электронов, но не могут присоединить к себе протоны. Следовательно, на этапе FeS-центров происходит разделение потока протонов и электронов, т.е. далее по цепи переносятся только электроны, а протоны на этом этапе выталкиваются в межмембранное пространство (ММП). До FeSцентров протоны и электроны переносились вместе в виде гидрид-иона.

ФМНН2 + Fe^S -» ФМН + Fe2+S 4- Н+ в ММП

ФМНН2, отдав электроны железу FeS-центров, а протоны в ММП, окисляется, FeS-центры, присоединив электроны - восстанавливаются.

3. Окисление FeS-центров убихиноном.

Убихинон или кофермент Q (quinone — Q - уби-вездесущий) найден практически во всех клетках. Это жирорастворимый хинон с длинной изопреноидной боковой цепью. Это единственный переносчик в цепи, не являющийся белком, он легко двигается в липидном слое мембраны. Убихинон выполняет коллекторную функцию, собирая восстановительные эквиваленты не только от НАДН-дегидрогеназ (полная дыхательная цепь), но и от ФАД-зависимых дегидрогеназ (укороченная дыхательная цепь).

Строение убихинона, механизм окисления

Fe2++

Убихинон может присоединять 1 электрон к своему 0 2 от Fe2+, кислород становится электроотрицательным и присоединяет протон из

113

матрикса, образуется семихинон. Однако убихинон может присоединят*, и 2 электрона, т.е. участвовать в двухэлектронном переносе, образу,, гидрохинон.

Когда электроны от железосерных центров ФМН-зависимы* дегидрогеназ переходят на убихинон, ФМН-зависимые дегидрогеназ^ окисляются, убихинон восстанавливается. Подчеркнем, что убихинон от восстановленных НАДН-дегидрогеназ присоединяет только электрону через железосерные центры. Протоны, которые присоединились „ убихинону, происходят из матрикса (возможно из внутренней мембраны митохондрий).

4. Окисление восстановленного убихинона цепью цитохромов.

Цитохромы это железосодержащие белки, окрашенные в красный или коричневый цвет. Они относятся к гемпротеинам, т.е. Fe входит в структуру гема. Они способны переносить электроны. Существуют 3 класса цитохромов: а, в, с, различающихся по спектрам поглощения. В дыхательной цепи они располагаются в порядке возрастания редокспотенциала:

в—►с, —►с—►аа3—►0 2

Входе переноса электронов атом Fe находится то в восстановленной форме Fez+, то в окисленной - форме Fe3+. Группа гема, как и FeS-центра переносит только 1 электрон в отличие от НАД, флавина и убихинона, переносящих по 2 электрона. Таким образом, восстановленный убихинон переносит свои 2 электрона на две молекулы цитохрома “в”. Fe в цитохроме “в” восстанавливается,

убихинон окисляется, протоны убихинона выталкиваются в ММП.

114

Цятохромы отличаются друг от друга строением гема, способом й рема с белковой частью. Простетической группой цитохромов “в”, с*„ “С,” служит протопорфирин IX (гем), как в миоглобине и

’глобине, цитохромы а и а3 имеют другую железопорфириновую

Гуппу, называемую гем “а”.

Связь гема с белковой частью цитохромов происходит по § и б координационным связям Fe

Все цитохромы прочно встроены в мембрану, исключением является цитохром “с”, который может свободно двигаться в плоскости мембраны, подобно убихинону.

Перенос электронов на 0 2 цитохромоксидазой, Цитохромы “а” и “аз” являются конечными звеньями дыхательной цепи. Они существуют в виде комплекса —цитохромоксидаза. Она содержит две молекулы гема “а” и 2 атома Си. Цитохромоксидаза может необратимо ингибироваться цианидами, угарным газом. Она имеет очень высокое средство к кислороду. Это позволяет дыхательной цепи функционировать с максимальной скоростью до тех пор, пока в ткани не будет практически исчерпан 0 2.

Цитохромоксидаза забирает 1 электрон от цитохрома “с”. Вначале электрон переносится на окисленное Fe3+ гема “а”, образуется восстановленное Fe2+. Электрон с Fe2+ дальше переносится на окисленную Си2+. В результате Fe окисляется, а Си восстанавливается в Си +. Си1+ отдает 1 электрон на 0 2. При этом Си окисляется, 0 2 - восстанавливается. Однако для восстановления 0 2 нужно 4 электрона, а группы гема являются переносчиками одного электрона. Каким образом четыре электрона “сходятся” для восстановления молекулы 0 2, пока не установлено.

0 2 + 4е + 4Н+ —*2Н20

Присоединение электрона к 0 2 сопровождается присоединением протонов, которые возвращаются в матрикс из ММП через канал АТФсинтазы.

115

Неполная (укороченная дыхательная цепь). В ней окисляются субстраты 1 рода. Первым звеном дыхательной цепи являются ФАД. зависимые дегидрогеназы. Это сложные ферменты, содержат простетические группы ФАД и FeS-ценгры. По субстрату их называют сукцинатдегидрогеназа, ацилКоА-дегидрогеназа. Они расположены во внутренней мембране митохондрий со стороны матрикса. Забирая атом водорода от окисляемого субстрата, они переносят электроны через FeS-центры на убихинон и далее цепь цитохромов, а протоны остаются в матриксе.

Строение ФАД (флавинадениндинуклеотид)

6. Структурная организация дыхательной цепи

Компоненты дыхательной цепи встроены во внутреннюю мито­ хондриальную мембрану в виде четырех белковых комплексов. Цито­ хром “с” и убихинон, будучи относительно мобильными компонентами дыхательной цепи, осуществляют связь между фиксированными ком­ плексами.

Ферментные комплексы цепи переноса электронов

116

аВ митохондриальных ферментных комплексов цепи переноса

Лекция 8

ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ

1. Определение понятия «окислительное фосфорилирование». Коэффициент окислительного фосфорилировшшя

В процессе тканевого дыхания от окисляемых субстратов отщеп­ ляются протоны и электроны. Они поступают на кофакторы НАД* и ФАД, которые передают их в дыхательные цепи. Передвигаясь от одно­ го переносчика электронов к другому, электроны опускаются на все бо­ лее низкие энергетические уровни, отдавая порциями свою энергию. В последнем звене цепи они восстанавливают молекулярный кислород. Освобожденная при переносе электронов по дыхательной цепи энергия запасается в фосфатных связях АТФ.

Синтез АТФ из АДФ и фосфорной кислоты, который проис­ ходит с использованием энергии, освобождающейся при окислении веществ и сопряжен с переносом электронов по дыхательной цепи, называется окислительным фосфорилированием.

Окислительное фосфорилирование было открыто в начале 30-х годов XX в. В.А. Энгельгардтом.

Коэффициент окислительного фосфорилирования (К) - это отношение количества неорганического фосфата, потребляемого в проЦессе дыхания, к количеству кислорода: Р/0, т.е. К показывает число молей АТФ, образующихся из АДФ и Рн на 1 грамм-атом поглощенного ОгПредложен в 1939г. В.А. Белицером.

Экспериментально установлено, что для субстратов, окисляю­ щихся в полной дыхательной цепи (яблочная, пировиноградная, изоли- м°нная кислоты) этот коэффициент равен 3, т.е. синтезируется 3 АТФ

1 1 7

на каждый атом 0 2, а для субстратов неполной дыхательной цепи - (сукцинат) —2 (соответственно образуется 2 молекулы АТФ).

2. Участки сопряжения в дыхательной цепи

Образование АТФ возможно в тех участках дыхательной цепи, где изменение свободной энергии при переносе электронов превышает изменение свободной энергии гидролиза АТФ, т.е. 30,5 кДж/моль. Этой величине соответствует величина редокс-потенциала 0,22 В. В полной дыхательной цепи есть 3 участка, отвечающих этим требованиям.

Участки сопряжения в полной дыхательной цепи

1.Между НАД-зависимой дегидрогеназой и ФМН-зависимой де­ гидрогеназой (комплекс I);

2.Между цитохромами «в» и «с» (комплекс III);

3.Между цитохромоксидазой и кислородом (комплекс IV).

Вэтих участках возможен синтез АТФ. Их называют участками сопряжения окисления и фосфорилирования. Здесь расположены фер­ менты дыхательной цепи (комплексы I, III и IV) и фермент синтеза АТФ —АТФ синтаза.

Сопряжение дыхания и синтеза АТФ Наружная мембрана митохондрии

АДФ

В местах расположения комплексов I, III и IV энергия переноса электронов используется для выкачивания протонов в межмембранное

118

пространство, т.е. возникает электрохимический потенциал (ЭХП). В настоящее время существует неясность в отношении механизма выде­ ления протонов, но его реальное существование не вызывает сомнений, возвращение протонов обратно в матрикс происходит через канал АТФ синтазы, в этот момент синтезируется АТФ.

При переносе электронов через всю дыхательную цепь от НАДН+Н+ к молекуле кислорода изменение свободной энергии сосгавдлет ~ 220 КДж/моль, а синтезируется 3 АТФ - т.е. 30,5-3=91,5 лДж/моль. Отсюда КПД дыхательной цепи ~ 41%. Остальная часть энергии рассеивается в виде тепла.

КПД полной дыхательной цепи

Энергия окисления субстратов - 220 кДж/моль. Синтез АТФ - 30,5x3=91,5 кДж/моль. 30,5 кДж/моль - нужро для синтеза 1 АТФ; 3 - количество синтезируемой АТФ в ПДЦ.

9 1 ,5 x 1 0 0

220

3. Гипотезы механизма окислительного фосфорилирования

Вопрос о механизме окислительного фосфорилирования - это вы­ яснение того, как энергия переноса электронов по дыхательной цепи трансформируется в энергию фосфатных связей АТФ. Для объяснения этого явления было предложено много гипотез, заслуживают внимания

- 3 .

1. Гипотеза химического сопряжения. Предложена Липманом, Слейтером, Ленинджером. Она рассматривает окислительное фосфори­ лирование по аналогии с субстратным фосфорилированием.

Механизм синтеза АТФ на 1 участке сопряжения:

НАДН + ФМН— ФМН2+ НАД1"

НАДН + X—»НАД+ +ХН2 ХН2 + Н3Р04- » Х Н 2-НзР04

Х Н 2 Н3Р 0 4 + Ф М Н -> Ф М Н Н 2 + Х~НзР04 Х~Н3Р04 + АДФ —>Х + АТФ

Макроэрг передается на АДФ и образуется АТФ.

Е о к^ Е .ч х кр —>ЕАТф

119

Сторонники этой гипотезы помещают в участки сопряжения ги­ потетические вещества, которые забирают протоны и электроны от пер. вого участника пункта сопряжения и взаимодействуют с Н3Р04. В мо­ мент отдачи протонов и электронов второму участнику пункта сопря­ жения, связь с фосфатом становится макроэргической.

Недостаток: до сих пор не открыли эти соединения.

2. Механохимическая или конформационная (Грин, Бойер, 60-е годы). Согласно этой гипотезе в процессе переноса протонов и электро­ нов изменяется конформация белков-ферментов. Они переходят в но­ вое, богатое энергией конформационное состояние, а затем при возвра­ щении в исходную конформацию отдают энергию для синтеза АТФ:

Е о к - * Е к о н ф .с д в ш — * Е Ат ф

И действительно, прямые эксперименты показывают, что мито­ хондрии могут сокращаться и расслабляться; на электронных фотогра­ фиях видно, что в покое внутренняя мембрана митохондрий шире, чем в процессе дыхания. Но связано ли это напрямую с синтезом АТФ -- не известно.

3. Хемиосмотическая гипотеза Митчелла.

Была сформулирована в 1961 г., многое для ее доказательства сделано В.П. Скулачевым. В 1978 г. Митчелл получил за нее Нобелев­ скую премию.

Гипотеза опирается на следующие положения:

1.Внутренняя мембрана митохондрий обладает высоким элек­ трическим сопротивлением и очень низкой проницаемостью для прото­ нов и гидроксид-ионов.

2.В ходе дыхания протоны скапливаются в межмембранном про­

странстве (ММП), т.е. возникает электрохимический потенциал (ЭХП). 3. Протоны могут вернуться в матрикс только через канал АТФ-

синтазы. В этот момент происходит разрядка мембраны и синтез АТФ.

Еок — * Еэхп ~ Е Атф

Все эти предположения в настоящее время экспериментально до­ казаны.

Предполагается, что во внутренней мембране митохондрий со­ держится система ферментов - протонных насосов, приводимых в дей­ ствие переносом электронов по дыхательной цепи. Используя энергию, выделяющуюся при переносе электронов, насосы выкачивают протоны из матрикса в ММП. В результате наружная сторона мембраны получа­ ет (+) заряд. В матриксе митохондрий образуется избыток ОН~, т.е. внутренняя сторона мембраны заряжается (-). Таким образом на внут-

120