Биохимия пособие Коновалова 2012

ренней мембране митохондрий одновременно с градиентом концентра­ ции протонов создается и градиент электрического потенциала - возникает ЭХП. Т.е. химическая энергия окисления трансформировалась в энергию ЭХП.

Избыток протонов из ММП стремится вернуться в матрикс по градиенту концентрации. Поскольку мембрана для них непроницаема 0ни двигаются по специальному протонному каналу АТФ-синтазы. Именно этот поток протонов и служит движущей силой для синтеза АТФ.

Согласно гипотезе Митчелла на каждые два протона прошедшие через мембрану, синтезируется 1 молекула АТФ. Следовательно, цепь переноса электронов должна содержать 3 протонных насоса, соответст­ вующих трем участкам фосфорилирования. Каждая пара электронов от субстратов окисления, транспортируемая от НАДН к кислороду, как бы извлекает три пары ионов НГ из матрикса в межмембранное пространст­ во, в результате при переносе двух электронов образуется 3 молекулы АТФ.

В момент возврата протонов из ММП в матрикс происходит раз­ рядка мембраны и освобожденная энергия ЭХП идет на синтез АТФ.

Еок^Еэхп- ^Едтф

Что же не доказано в этой гипотезе: 1) точная локализация протон­ ных насосов, 2) механизм перехода электрической энергии в химиче­ скую энергию связей АТФ.

Гипотеза Митчелла

Перенос электронов с окисляемых субстратов на кислород (дыхание)

Перенос протонов из матрикса митохондрий в межмембранное пространство и образование трансмембранного электрохимического

потенциала

Синтез АТФ за счет потока протонов из межмембранного про­ странства в матрикс (окислительное фосфорилирование)

4. Строение Н+АТФсинтазного комплекса (или АТФсинтазы)

Этот комплекс по форме напоминает гриб, ножка которого по­ гружена в мембрану, а круглая шляпка выступает наружу.

121

Состоит из растворимой АТФазы (фактор Fj) и мембранных компонентов (комплекс F0). располагается на поверхности внутренней мембраны со стороны матрикса и обладает каталитической активно, стью синтеза или гидролиза АТФ. Комплекс F0состоит из нескольких полипептидных субъединиц, он образует протонный канал в мембране.

Схема расположения Н+АТФсинтазных комплексов в мембранах хлоропластов (а) и мито­

хондрий (б)

Пространственное строение Н*АТФсинтазного комплекса

...... W*

Роль АТФазы заключается в следующем:

1.Перенос протонов из ММП в матрикс - осуществляется про­ тонным каналом F0.

2.Гидролиз АТФ - осуществляется фактором Fi.

3.Синтез АТФ —осуществляется комплексом F0- F |.

122

д° сях пор не раскрыт механизм превращения энергии тока проСили энергии «разрядки» мембраны) в энергию АТФ. Возможно, Т°Я°В«исходит следующим образом. Субъединица F] имеет два центра эт° П аНия' первый - с АДФ, другой - с Н3Р04. Причем фосфат присоеотверстия протонного канала (субъединицы F0).

Д ^ ода1, двигаясь через канал из ММП в матрикс, сталкиваются с фос- ДР отрьщают от него один атом кислорода В результате образуется сокореактивный богатый энергией радикал фосфорил. Он самопроиз­

вольно присоединяется к АДФ, образуя АТФ.

5. Дыхательный контроль

Для синтеза АТФ в процессе тканевого дыхания необходимо

наличие:

1) Субстратов окисления.

2) 02.

3) Субстратов фосфорилирования, т.е. АДФ и Рн.

В зависимости от соотношения этих компонентов различают 5 со­ стоянийдыхательной цепи:

1. Нет субстратов окисления и субстратов фосфорилирования. Скорость дыхания очень низкая.

2.Нет субстратов окисления, а субстратов фосфорилирования достаточно. Дыхание ограничено.

3.Активное дыхание. В избытке субстраты окисления и фосфори­ лирования. Скорость дыхания высокая. Происходит синтез АТФ. В ре­ зультате уменьшается содержание АДФ и дыхание переходит в состоя­

ние 4.

4. Состояние дыхательного контроля. Когда весь АДФ превратит­ ся в АТФ, дыхание затормозится. На сопрягающей мембране накапли­ вается ЭХП, т.к. мембрана не может разрядиться из-за отсутствия АДФ. Мембранный потенциал препятствует движению электронов по дыха­ тельной цепи, т.е. прекратится и окисление субстратов. Возврат в со­ стояние 3 (активное дыхание) возможен при расходе АТФ и увеличении концентрации АДФ.

5. Нет Ог - дыхание прекращается (анаэробиоз).

Дыхание дает энергию для синтеза АТФ. Много АТФ —не нужно окислять субстраты, т . е . не нужно дыхание. Мало АТФ (много АДФ) - Дыхание ускоряется. Следовательно, регуляция цепи переноса электро­ нов или скорости дыхания осуществляется отношением АТФ/АДФ. Чем меньше это отношение (преобладание АДФ), тем интенсивнее идет Дыхание, обеспечивая выработку АТФ.

Изменение скорости дыхания с изменением концентрации АДФ носит название дыхательного контроля.

123

Пример. Для состояния покоя в мышцах характерна низкая ско­ рость дыхания, низкая концентрация АДФ и высокая —АТФ. Если вы­ звать ряд сокращений мышцы, то АТФ—>АДФ + Рн, т .е . увеличится кон­ центрация АДФ. Это приводит к повышению скорости дыхания (иногда в 100 раз), что в свою очередь, приведет к превращению АДФ в АТФ. Высокая скорость дыхания будет сохраняться до тех пор, пока АТфзависимая сократительная система будет функционировать и поставлять АДФ.

6. Разобщители тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования

Сопряжение между дыханием и синтезом АТФ может быть нару­ шено разобщителями. Разобщители нарушают дыхательный кон­ троль ( т . е . стимулируют дыхание в отсутствие синтеза АТФ) и стимулируют гидролиз АТФ в митохондриях.

Механизм действия разобщителей стал хорошо понятен после ги­ потезы Митчелла. Основное ядро этой гипотезы - создание ЭХП за счет избирательной проницаемости внутренней мембраны митохондрий для протонов. Если мембрана потеряет эту избирательность, т.е. протоны смогут проходить через мембрану в любом месте, не будет создаваться ЭХП, а значит, не будет синтезироваться АТФ, т.е. энергия окисления будет рассеиваться в виде тепла. Оказалось, что все разобщители имели общее свойство: они являлись протонофорами - т.е. переносчиками протонов. Они переносят протоны через мембрану в любом месте, а не только в пунктах сопряжения, это приводит к выравниванию градиента pH и мембранного потенциала. Энергия окисления рассеивается в виде тепла. Ученые В.П. Скулачев, Либерман показали, что разобщители резко понижают сопротивление мембран, т.е. экспериментально доказа­ ли гипотезу Митчелла.

В норме ~ 60% энергии окисления рассеивается в виде тепла. В этом заключается терморегуляторная функция тканевого дыхания.

Не может ли организм воспользоваться разобщением при небла­ гоприятных внешних условиях, например при переохлаждении? Здесь весьма кстати старая пословица «Не до жиру, быть бы живу». Лучше уж обойтись без синтеза АТФ, чем окоченеть на морозе. Надежным подтверждением этого послужили остроумные опыты В.П. Скулачева (1958-1960), в то время аспиранта кафедры биохимии животных МГУ. Предоставим слово самому автору. «Мне не приходилось видеть ничего более жалкого, чем голубь без перьев. Дрожащий, иссиня-красный ко­ мочек стыдливо переминающийся с ноги на ногу и посматривающий с укоризной на своих мучителей. Нет, такой не вынесет двадцатигра­ дусного мороза с ветром. Спустя полчаса после начала охлаждения, мы

124

да холодильника полумертвую nmutfy с температурой тела оковЫ ^QC£' вместо нормальной для голубя 41,5°С. Измерили дыхание и

Н°Р голубя при повторном охлаждении на следующий день разитель- ° отличалось от той трагической картины, что мы видели накануне. ^Снизив свою температуру на 2-3 °С, голубь умудрился каким-то обра­ зом остановить дальнейшее остывание тела. Через 3 часа после нача­ ла охлаждения, заглянув в очередной раз в холодильник, мы обнаружи­ ла что голубь ведет себя вполне бодро и как-то даже агрессивно по­ сматривает на нас из своего ледяного плена. Ну, как там его митохон­ дрии? Есть разобщение? Дыхание отключилось от синтеза АТФ. Энер­ гия больше не накапливалась, а тотчас превращалась в тепло.

Потам такой же опыт был проделан на мышах, и вновь при по­ вторном охлаждении наблюдалось разобщение дыхания и фосфорили­ рования. Охлаждаясь впервые, мыши, как и голуби (в наших суровых ус­ ловиях опыта), отключить синтез АТФ не умели и гибли, если охлаж­ дение не прекращалось. Им удалось продлить жизнь инъекцией искус­ ственного разобщителя — динитрофенола... Впоследствии оказалось, что в разобщении на холоду замешаны свободные жирные кислоты, которые действительно повышают протонную проводимость мем­ браны».

Справедливости ради добавим, что подобные опыты, правда в несовершенном виде, проводились в России еще в XVIII столетии, когда небезызвестная императрица Анна украшала, прибегая к услугам своего фаворита Бирона, ледяные дворцы статуями из прижизненно заморо­ женных крепостных крестьян. В несколько ином ключе, уже в нашем веке, решали вопрос некоторые западные бизнесмены. Они продавали разобщители окислительного фосфорилирования желающим похудеть или улучшить фигуру. К сожалению, во многих случаях пациент, приоб­ ретая изящные формы, вскоре становился клиентом похоронного бюро.

Действие разобщителей

При действии разобщителей (лекарственные препараты - аминобарбитал, валиномицин, 2,4-динитрофенол, продукты жизнедеятельно­ сти микробов) более 60% энергии окисления идет на образование тепла

гипертермия.

Существуют эндогенные разобщители - фенолы, ненасыщенные жирные кислоты и их пероксиды.

Разобщение окисления и фосфорилирования наблюдается при Действии экстремальных температур, радиации.

125

У новорожденных находится особый бурый жир, богатый мито­ хондриями. Особенность этих митохондрий - на внутренней мембране очень мало пунктов сопряжения, а значит, почти вся энергия окисления рассеивается в виде тепла. Это имеет значение для защиты ЦНС ребенка от возможного переохлаждения, т.к. у них еще плохая терморегуляция.

Известно, что в бурой жировой ткани имеются специфические белки-термогенины, которые могут разобщать дыхание и фосфорилиро­ вание, участвуя в переносе протонов в матрикс митохондрий.

При охлаждении из симпатических нервных окончаний в бурой ткани освобождается норадреналин и выполняет двоякую функцию: вопервых, он активирует термогенины, а во-вторых, в адипоцитах он ак­ тивирует гормоночувствительную триглицеринлипазу и стимулирует высвобождение жирных кислот.

В свою очередь выделение норадреналина стимулируется тироидными гормонами, концентрация которых в крови повышается при ох­ лаждении.

7. Гипоэнергетические состояния

Если на синтез АТФ идет меньше энергии, чем обычно, то насту­ пает гипоэнергетическое состояние.

Причины развития гипоэнергетических состояний:

1)Нарушена доставка субстратов окисления (голод).

2)Нарушено поступление 0 2(гипоксия).

—снижение концентрации кислорода в воздухе;

—нарушения работы сердечно-сосудистой и дыхательной сис­ тем, которые обеспечивают доставку кислорода к клеткам;

—анемия различного происхождения.

3)Повреждение внутренней мембраны митохондрий (или дейст­ вуют разобщители).

4)Различные типы гиповитаминозов - нехватка витаминов РР,

В2, В] и др., из которых образуются коферменты, участвующие в реак­ циях энергетического обмена.

126

Лекция 9

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ, НЕ СВЯЗАННЫЕ С ЗАПАСАНИЕМ ЭНЕРГИИ

1. Свободное окисление. Роль в теплопродукции

Свободное окисление « Тканевое дыхание, происходящее без сопряжения с окисли­

тельным фосфорилированием, называется свободным. Свободное дыхание участвует:

1.В терморегуляторном образовании теплоты.

2.В образовании или разрушении метаболитов.

3.Детоксикации ксенобиотиков.

Выделяющаяся при этом энергия окисления рассеивается в виде тепла. Свободное дыхание (окисление) объединяет как разобщенные, так и первично не сопряженные дыхательные системы.

1.1. Первично не сопряженные дыхательные системы

Пероксидазный путь окисления —это окисление субстрата пу­ тем дегидрирования, водород сразу переносится на кислород с образо­ ванием перекиси - Н20 2.

SH2 + 0 2 —►S + Н20 2 + Q

Энергия окисления рассеивается в виде тепла. Это простые окис­ лительные системы. Окисление происходит с участием аэробных дегид­ рогеназ. Это флавопротеины, содержащие в качестве простетической группы ФАД или ФМН. Часто в их состав входят и металлы, т.е. они являются металлофлавопротеинами. В клетке около 80% этих фермен­ тов сосредоточено в пероксисомах. Кроме того, они встречаются в мем­ бранах, соприкасающихся с цитозолем. Субстратами окисления служат альдегиды, амины, Д и L аминокислоты, пурины. Некоторые из них токсичны для организма.

Интенсивно проходит пероксидазное окисление в лейкоцитах, макрофагах и др. клетках, способных к фагоцитозу. Это связано с тем, что образующаяся Н20 2 используется для обезвреживания бактерий, распада токсичных продуктов. Однако избыточное накопление Н20 2 токсично, т.к. оно ведет к генерации свободных радикалов, повреж­ дающих мембраны клеток. Поэтому простые окислительные системы требуют дополнительных ферментов для обезвреживания Н20 2. Это ферменты пероксидаза, каталаза.

127

Оксигеназный путь окисления. Оксигеназы подразделяются на

2подгруппы.

1.Диоксигеназы (кислород-трансферазы, истинные оксигеназы Катализируют включение в молекулу субстрата обоих атомов молекулы

02. Например: гомогентизатоксигеназа катализирует разрыв ароматиче­ ского кольца гомогентизиновой кислоты. При врожденном дефекте данного фермента в моче больного накапливается гомогентизиновая ки­ слота. Она под действием воздуха окисляется в пигмент черного цвета - алкаптон, который выделяется с мочой и развивается алкаптонурия (моча черного цвета).

Оксигеназы участвуют в синтезе и деградации многих типов ме­

таболитов. Включение кислорода происходит в две стадии: 1. 02связывает с активным центром фермента,

2. Происходит реакция, в результате которой связанный 0 2вос­ станавливается или переносится на субстрат.

Эти ферменты могут содержать в качестве активной группы гем или негемовое Fe, Чаще всего они катализируют разрыв двойной связи в ароматическом кольце.

2. Монооксигеназы (оксидазы со смешанной функцией, гидро ксилазы). Эти ферменты катализируют включение в субстрат только одного из атомов молекулы кислорода. Другой атом кислорода восста­ навливается до воды. Для этой цепи необходим дополнительный донор водорода (косубстрат).

S - н + о 2+ ZH2- С S - о н + н 2о + Z,

где Z —косубстрат.

Монооксигеназы часто участвуют в метаболизме лекарств. В ходе монооксигеназного окисления повышается растворимость веществ, мо­ гут появляться новые фармакологические свойства. Монооксигеназный путь окисления локализован в мембранах эндоплазматического ретику­ лума. При разрушении клетки мембраны эндоплазматического ретику­ лума собираются вместе, образуя пузырьки - микросомы. Отсюда часто монооксигеназный путь окисления называют кратко - микросомальное окисление.

Для работы монооксигеназной системы необходимы следующие основные компоненты:

1.Неполярный окисляемый субстрат;

2.Кислород;

3.Дополнительный субстрат (косубстрат) - донор водорода -

НАДФН2; 4. Цитохромы Р450.

Цитохромы Р450получили свое название вследствие способности в

128

виде восстановленного комплекса иметь максимум поглощения при длине волны 450 нм. Цитохром Р450выполняет двоякую функцию:

1)Связывает субстрат окисления,

2)Проводит активацию молекулярного 0 2.

Микросомальное окисление представляет собой короткую цепь, состоящую из НАДФН2, ФАД, железосерных белков, цитохромов Р450, в5, флавопротеинов, содержащих ФАД.

В общем виде микросомольное окисление неполярных ксенобио­ тиков (лекарств) осуществляется с помощью гидроксилазного цикла. Вначале первый (основной) субстрат окисления R-CH3в мембране свя­ зывается с цитохромом Р450, железо в котором в форме Fe3+. Чтобы к этому комплексу R-CH3присоединился 0 2, нужно Ре2+. Поэтому одно­ временно с этой реакцией НАДФН2(косубстрат) окисляется флавопротеином, протоны и электроны передаются на ФАД и затем с помощью FeS белков происходит разделение потоков протонов и электронов. Первый электрон восстанавливает Fe3+ в Fe2+ в комплексе цитохром P450-R-CH3. Этот комплекс может уже связать молекулу 0 2. Второй электрон от FeS активирует молекулу 0 2в комплексе и образуется сво­ бодный радикал кислорода, он очень активный и происходит введение одного атома 02 в субстрат с образованием гидроксильной группы, а второй атом 0 2—соединяется с двумя протонами, образуя Н20. В ре­ зультате гидрофобный субстрат приобретает гидрофильные свойства, т.е. возможность выведения из организма с мочой. Так окисляются мно­ гие ксенобиотики, лекарства (морфин, фенобарбитал). В настоящее время известно свыше 7000 соединений способных окисляться монооксигеназными системами. Это основной путь обезвреживания и выведе­ ния ксенобиотиков. К сожалению, есть и исключения: монооксигеназная цепь, окисляя нетоксичный бензпирен (табачный дым, копчености) приводит к образованию токсичного оксибензпирена - сильного канце­ рогена. Это летальный синтез.

Монооксигеназная цепь содержится также в митохондриях на внутренней стороне внутренней мембраны. Она выполняет биосинтети­ ческую роль, т.е. введение ОН-группы при синтезе стероидных гормо­ нов из холестерина в коре надпочечников, тесгикулах, яичниках, пла­ центе. Таким путем образуется активная форма витамина Д в печени — 3,25 дигидроксикальциферолы, желчные кислоты из холестерина в пе­ чени.

2. Свободно-радикальное окисление

Кислород —потенциально токсическое вещество, до сих пор его токсичность связывали с образованием Н20 2. В настоящее время ток­ сичность 02связывают с его свободнорадикальными формами.

129

Под свободным радикалом понимают молекулу или ее часть, имеющую неспаренный электрон на молекулярной или на внешней (валентной) атомной орбитале.

Молекулярный 0 2парамагнитен и обладает двумя не спаренными электронами. Они находятся на разных орбиталях. Восстановление 02 путем прямого введения пары электронов в его частично заполненные орбитали затруднено, т.к. существует «спиновый» запрет. Спиновый запрет —на орбитали могут находиться два электрона с разнона­ правленными спинами, т.е. присоединение пары электронов долж­ но сопровождаться «обращением» спина одного из электронов. Спиновый запрет восстановления кислорода может быть преодолен по­ следовательным добавлением одиночных электронов. Поэтому <Э2легко вступает в реакции с веществами, содержащими одиночные неспарен­ ные электроны. В одноэлектронных реакциях восстановления 0 2участ­ вуют свободнорадикальные промежуточные продукты. Полное восста­ новление 0 2до Н20 требует четырех электронов.

При одноэлектронном восстановлении в качестве промежуточных продуктов возникают 1) супероксидный анион 0 2", 2) пероксид Н20 2; 3) гидроксидный радикал ОН*. Эти продукты очень реакционоспособны, и их присутствие может представлять угрозу для целостности живых систем. ОН* —наиболее мутагенный продукт ионизирующей радиа­ ции, представляет собой чрезвычайно мощный окислитель, который может атаковать все органические соединения. Одноэлектронное восстановление инициирует цепь реакций, которые ведут к образова­ нию OFT.

Образование свободных радикалов:

02+ ё —» 02* супероксидный

0 2'* + Н+ —>Н02* пероксидный 02“* + но2+ Н+—> Н202+ о2

0 2‘* + Fe3+ -» 0 2+ Fe2+

Н20 2+ Fe2+—» Fe3++ ОН + ОН* гидроксидный

В процессе тканевого дыхания происходит одноэлектронный пе­ ренос, т.е. всегда имеются возможности для генерации свободных ради­ калов.

3. Пероксидация жирных кислот

Хорошо известно, что жиры при длительном хранении в условиях доступа кислорода и света подвергаются прогорканию, что связано с ау-

1 3 0