Биохимия пособие Коновалова 2012

сворачивания полипептидной цени в нативную конформацию

Всередине 80-х годов XX века началась новая эра в исследова-

Имеханизмов регуляции сворачивания белков in vivo. Было обнаручто в клетке существует особая категория белков, основной

дикцией которых является обеспечение правильного характера свочивания полипептидных цепей в нативную структуру. Эти белки, Называясь с развернутой или частично развернутой конформацией полипептидной цепи, не дают ей «запутаться», образовать неправиль­ ные структуры. Они удерживают частично развернутый белок, способ­ ствуют его переносу в разные субклеточные образования, а также соз­ дают условия для его эффективного сворачивания. Эти белки получи­ ли название «молекулярные шапероны», образно отражающее их функцию (английское слово chaperone близко по смыслу к слову «гу­

вернантка»).

К настоящему времени описано несколько классов шаперонов, различающихся по структуре и специфическим функциям. Все шапе­ роны являются так называемыми «белками теплового шока», синтез которых резко увеличивается в стрессовых для клетки ситуациях. По­ этому сокращенное название этих белков —hsp (heat shock proteins). Однако и в нормальных условиях каждая клетка содержит определен­ ный набор шаперонов, необходимых для ее жизнедеятельности. Клас­ сификация шаперонов основана на величине молекулярной массы со­ ставляющих их полипептидных цепей (субъединиц), которая варьирует от 10 кДа (килодальтонов) (для белка hsp10) до 90 кДа (для белка hsp90) и выше. По характеру выполняемых этими белками функций их можно разделить на два больших семейства - шапероны, или hsp70, и шаперонины, к которым относятся hsp60 и hsplO.

Шапероны, удерживающие белки в развернутом состоянии

Взаимодействие шаперонов с синтезируемым белком начинается еще до схождения полипептидной цепи с рибосомы. Связываясь с от­ дельными участками «опекаемой» ими полипептидной цепи, молекулы hsp70 образуют прочные комплексы, удерживающие цепь в разверну­ том состоянии. Взаимодействие не является специфическим (шаперо­ ны не различают белки по их аминокислотной последовательности) и в основном реализуется благодаря силам гидрофобного характера. Прочно фиксированная на шаперонах полипептидная цепь не способна к сворачиванию в нативную структуру, так как не обладает необходи- м°й для этого подвижностью. Главная функция hsp70 состоит в Удержании вновь синтезируемых белков от неспецифической агреГаЧии и в их передаче другому «белку-помощнику», шаперонину,

31

I

роль которого —обеспечить оптимальные условия для эффектив­ ного сворачивания.

В клетках эукариот шапероны выполняют также важную роль в транспорте белков через мембраны митохондрий, хлоропластов и эн­ доплазматического ретикулума. Такой транспорт необходим, так как многие белки клеточных органелл синтезируются в цитоплазме, а окончательно сворачиваются в месте своей постоянной локализации. Роль hsp70, «подносящего» к мембране частично развернутый белок, становится понятной, если учесть, что разворачивание - обязательное условие проникновения белковой молекулы через мембрану. Интерес­ но, что митохондриальный матрикс содержит собственные шапероны, «подхватывающие» пересекающий мембрану белок и способствующие его «втягиванию» в митохондрию. Аналогичный механизм реализуется и при проникновении синтезированных в цитоплазме белков в просвет эндоплазматического ретикулума. Описанные функции шаперонов hsp70 иллюстрируются следующей схемой.

«Ьудалздмтичфскии

решкулуи

Участие шапероиов и шаперонинов в сворачивании белка в клетке эукариот. 1- Сходящая с рибосомы полипептидная цепь, связанная с шаперонами hsp70 цитоплазмы; 2- шапероны hsp70 экранируют гидрофобные области полипептида,

32

едотврашая его агрегацию; 3- белки, сворачивающиеся в цитоплазме, протея с шаперона hsp70 на цитоплазматический шаперонин, где и ппоисходит сворачивание; 4- белки, сворачивающиеся в митохондрии. ,^плазматический шаперон hsp70 «подносит» развернутый белок к внешней мембране митохондрии. Митохондриальный шаперон hsp70, прочно связываясь с пересекающим мембрану белком, способствует его втягиванию внутрь ипохондрии, а затем передают его на митохондриальный шаперонин, где и происходит сворачивание; 5- белки, сворачивающиеся в эндоплазматическом ретикулумеЦитоплазматический шаперон hsp70, с одной стороны, и шаперон hsp70 просвета эндоплазматического ретикулума, с другой, обеспечивают проннкноиение развернутого белка через мембрану. Детали сворачивания таких

белков пока нс выяснены

Н.К. Наградова, 1996 г.

Возникает вопрос: от чего же зависит прочность связывания ша­ перона с полипептидной цепью? Каков механизм, позволяющий раз­ вернутому белку освободиться от hsp70 и перейти на шаперонин (hsp60)? Детальные исследования, проведенные на системах белков, выделенных из клеток бактерий, показали, что главным фактором яв­ ляется способность шаперона связывать АТФ, в определенных услови­ ях осуществлять его гидролиз и изменять прочность взаимодействия с полипептидной цепью в зависимости от природы связанного нуклео­ тида (АТФ или АДФ).

Шаперонины, обеспечивающие эффективное сворачивание белков

В отличие от довольно просто построенных шаперонов (состоя­ щих из одной—двух полипептидных цепей —субъединиц), шаперонины представляют собой сложные олигомерные структуры. Наиболее изу­ ченные hsp60 митохондрий, а также клеток Е. coli, построены из 14 субъединиц, организованных в два семичленных кольца, лежащих од­ но под другим. В центре построенного таким образом цилиндра имеет­ ся полость - канал (диаметром 45 ангстрем), в котором и происходит сворачивание полипептидной цепи, перешедшей на шаперонин с ша­ перона hsp70. На рисунке также показана структура hsplO, маленького белка, также образующего олигомерную структуру - кольцо из семи субъединиц, способное, как «шапочка», прикрывать вход в канал мо­ лекулы шаперонина после того, как туда попадает полипептидная Цепь.

Создав шаперонины, природа нашла элегантный способ обеспе­ чить сворачивание белка в условиях, исключающих его агрегацию с Другими белками внутри клетки. Действительно, попадая в централь­ ный канал молекулы шаперонина, единичная полипептидная цепь ока­ зывается полностью изолированной и получает возможность реализо­

33

вывать медленные стадии сворачивания с очень высоким выходом на­ тивного белка. Как и в случае hsp70, связывание развернутого белка с шаперонином и его отщепление регулируются АТФ-азной активно­ стью шаперонина. В связывании сворачивающегося белка (находяще­ гося в состоянии «расплавленной глобулы») может принимать участие каждая из 14 субъединиц олигомерной молекулы шаперонина. Количе­ ство мест связывания зависит от стадии сворачивания: чем ближе структура к нативной, тем меньше участков, «распознаваемых» шапе­ ронином. Роль маленького шаперонина hsplO, называемого кошаперонином, закрывающего вход в центральный канал, состоит в том, чтобы предотвращать «преждевременный» выход во внешнюю среду белка, не завершившего окончательное сворачивание в нативную структуру.

Структура шаперонина hsp60 и его кофактора - hsplO.

Показано проникновение полипептидной цепи в центральный канал молекулы hsp60, сопровождающееся присоединением hsplO и закрыванием входа в канал

Н.К. Наградова, 1996 г.

hspSO

На рисунке ниже показан принцип функционирования такой сис­ темы. Данная модель дает лишь самое общее представление о меха­ низмах функционирования шаперонинов. Она основана на изучении этих белков, изолированных из митохондрий или бактериальных кле­ ток. Между тем, недавно было выяснено, что цитоплазматический шаперонин клеток эукариот весьма существенно отличается по своим свойствам: он построен из неодинаковых субъединиц и, по-видимому, не взаимодействует с ко-шаперонином. Вероятно, что общие принци­ пы функционирования, установленные для hsp60, распространяются и на этот шаперонин, однако конкретные механизмы, вовлеченные в ре­ гуляцию эффективности сворачивания белков в разных компартментах клетки, могут существенно различаться.

34

котором шаперонин такой белок не связывает. Вверху показан hsplO, который „ссоштрусг по окончании сворачивания. 1- Белок в состоянии «расплавленной глобулы» связан с гидрофобными участками «стенок» центрального канала молекулы шаперонина. Это взаимодействие стимулирует присоединение АТФ, в результате которого структура шаперонина меняется (гидрофобные участки «стенок» экранируются), и белок освобождается, переходя в центральный канал

(2) Спонтанное сворачивание белка продолжается до тех пор, пока не произойдет гидролиз АТФ и переход шаперонина в состояние, способное связывать частично развернутый белок (3). Стадии 1, 3 и 5 различаются количеством «развернутых» участков структуры белка, взаимодействующих со «стенками» центрального канала. Стадия 7: нативный белок, не способный связываться с шаперонином, выходит наружу

Н.К. Наградова, 1996 г.

Успехи, достигнутые в понимании общих принципов организа­ ции полипептидной цепи в уникальную пространственную структуру, а также внутриклеточных механизмов контроля за процессом сворачи­ вания белка, привели к формированию особой области исследований, объединяющей усилия биохимиков, молекулярных биологов и клеточ­ ных биологов. Главными проблемами, которые предстоит решить, ос­ таются расшифровка второй половины генетического кода (понимание структурных основ, определяющих путь сворачивания полипептидной цепи), с одной стороны, и выяснение молекулярных механизмов регу­ ляции скорости и эффективности этого процесса, —с другой. Накоп­ ленная к настоящему времени информация позволяет заключить, что определяющую роль в такой регуляции играют белок-белковые взаи­ модействия. Они реализуются, во-первых, между выставленными на поверхность участками полипептидной цепи и специальными белками, имеющими две функции: 1) предотвращать неспецифическую агрега­ цию вновь синтезируемых белков и 2) обеспечивать транспорт этих белков в те внутриклеточные компартменты, где они постоянно лока­ лизуются и функционируют. Такая, образно выражаясь, диспетчерская роль шаперонов дополняется их участием в проникновении белков че­ рез мембраны. Способность шаперонов (и шаперонинов) распознавать ненативные участки структуры белков лежит также в основе механиз­ ма, обеспечивающего чрезвычайно высокую эффективность сворачи­

35

1

вания.

Второй уровень белок-белковых взаимодействий, вовлеченных в регуляцию сворачивания белка in vivo —это взаимодействия между субъединицами в сложных молекулах шаперонинов, обеспечивающие согласованное изменение их конформации в каждом цикле сворачива­ ния. Эта очень интересная область остается пока почти не разработан­ ной.

Не подлежит сомнению, что важнейшую роль в регуляции свора­ чивания белков in vivo играют белок-белковые взаимодействия третье­ го уровня, возникающие между отдельньми белками-шаперонами. Скорее всего, клетка располагает высоко организованными ансамбля­ ми белков, действующих согласованно. В состав таких ансамблей, ве­ роятно, образующихся в цитозоле эукариотической клетки, входят, помимо hsp70, шапероны других типов (например, hsp90 и связанные с ним низкомолекулярные шапероны, не требующие АТФ для своего функционирования), ферменты, ускоряющие процесс сворачивания, а также ряд других белков, роль которых пока остается неясной. Рас­ шифровка молекулярных механизмов функционирования таких «ма­ шин сворачивания» - одна из актуальных проблем современной науки.

Функции шаперонов сводятся не только к участию в формирова­ нии нативной структуры. Белок hsp90 играет крайне важную роль в об­ разовании комплекса стероидных гормонов с их рецептором. Вместе с hsp70 и другими белками hsp90 контролирует функциональную актив­ ность рецепторов стероидных гормонов, направляя их «поведение» в клетке. Установлено, что hsp90 образует комплексы с некоторыми протеинкиназами, контролируя их активность. В свою очередь, протеинкиназы фосфорилируют самые различные клеточные белки и благодаря этому регулируют их активность. Hsp90 обнаружен в клетках растений, однако сведений о его функции у растений пока нет.

К шаперонам относится также убиквитин - белок, присоедине­ ние которого к N-концу полипептида делает этот полипептид мишенью для разрушения протеазами. Это «метка смерти» для белков, и при ее помощи происходит выбраковка поврежденных, недостроенных и функционально неактивных полипептидов. Ассоциированный с убиквитином белок разрушается в особых мультикомпонентных комплек­ сах, называемых протеасомами. Тепловой шок приводит к появлению в клетках недостроенных и поврежденных белков, для удаления кото­ рых важен убиквитин. Вместе с тем появление поврежденных и недо­ строенных белков в клетках является сигналом к синтезу шаперонов даже при нормальной температуре.

3 6

Лекция 2

^ТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И С 1 КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА

Способность белков к специфическим взаимодействиям

Одним из важнейших свойств белков, лежащих в основе их био­ логических функций, является способность к специфическим взаимо­ действиям. Такое взаимодействие оказывается возможным, если у бел­ ковой молекулы и вещества, с которым она взаимодействует, имеются на поверхности функциональные группы, способные образовать связи между собой. Это могут быть ионные, водородные связи, силы гидро­ фобного взаимодействия. Такие поверхности, имеющие функциональ­ ные группы, которые соответствуют друг другу, называются компле­ ментарными. Если на поверхности белковой молекулы имеется гидро­ фобная группа, то на другой молекуле также должна быть гидрофобная группа, если имеется группа с положительным зарядом -NH3+, то на второй поверхности должен быть отрицательный заряд -СОСГ. Специ­ фичность взаимодействия молекул определяется способностью образо­ вать между участками поверхностей молекул максимально возможное число связей.

При этом важной особенностью белков является также их способ­ ность изменять свою конформацию (т.е. пространственную конфигура­ цию), подгоняя ее к поверхности лиганда. Примером такой подгонки является формирование активного центра фермента при его взаимодей­ ствии с субстратом (по Кошланду). Присоединение лигандов к белко­ вым молекулам происходит по большому числу центров связывания.

Специфичность взаимодействия белков лежит в основе действия ферментов при их соединении с субстратами, в основе реакций анти- ген-антитело, а также взаимодействия гормонов с рецепторами, ко­ торые являются белками, в основе образования сложных белков: нук- лео-, липо-, гликопротеинов и др.

Самосборка белков и надмолекулярных структур

Это же специфическое взаимодействие лежит в основе процесса самосборки олигомерных белков (т.е. белков, имеющих в своем составе Несколько полипептидных цепей) и надмолекулярных структур.

Соединение протомеров или субъединиц в олигомерную молекулу (мультимер) происходит за счет взаимодействия определенных кон­ тактных участков, между которыми образуются десятки связей.

Процесс самосборки отличается высокой специфичностью. Про­

37

щ

томеры белка «узнают» друг друга и соединяются только между собой комплементарными поверхностями, и ошибочное соединение практиче­ ски невозможно.

Примером олигомерного белка является молекула гемоглобина, состоящая из 4-х субъединиц (4 полипеггтидных цепей двух типов аарр). Одноименные субъединицы, в основном, связаны между собой ионными связями, а разноименные - в основном, гидрофобным взаимо­ действием. При обработке раствором мочевины молекула гемоглобина распадается на четыре неактивных протомера, а после удаления моче­ вины они вновь соединяются, образуя нативную молекулу гемоглобина.

Примерами самосборки является образование молекулы вируса табачной мозаики, клеточных структур —мембран, микротрубочек и т.д.

Количественное определение белков

Все методы количественного определения белков делят на две группы.

Первая группа основана на физико-химических свойствах:

-Биуретовый (определяют интенсивность окраски комплексного соединения белка с ионами двухвалентной меди фиолетового цвета, об­ разующегося в щелочной среде).

-Основанные на оптических свойствах белков.

-Нефеламетрический - по степени мутности раствора белка.

-Рефрактометрический - основан на способности раствора белка преломлять проходящий луч света, а степень рефракции зависит от ко­ личества, размеров и физического состояния растворенных частиц.

-Спектрофотометрический - основан на способности остатков ароматических аминокислот (радикалов) поглощать в ультрафиолето­ вой части спектра при А=280 нм.

Все эти методы позволяют определить суммарное количество белков в исследуемом материале.

Для количественного определения индивидуальных белков исполь­ зуется вторая группа методов на основе их биологических свойств (специфичности взаимодействия): это иммунорадиометрический и иммуноферментный.

Радиоиммунологический анализ основан на способности белков к специфическим взаимодействиям. Он широко используется для диагно­ стики опухолей, так как некоторые из них образуют характерные анти­ гены, которые можно найти в крови или моче (хорионный гонадотро­ пин, плацентарная щелочная фосфатаза и др.). Этим методом можно оп­ ределять количество димеров пиримидина в ДНК после облучения ультрафиолетовыми лучами, даже очень малые количества клинически важных веществ (гормонов, антигемофилического фактора, вирусных

38

нов), фармакологических агентов (морфина, опийных алкалоиаНТИсеРДеЧ'ных гликозидов>барбитуратов и др.).

^ ля антиген-антитело. Образующийся комплекс выделяют, подсчиты­ вают радиоактивность и определяют количество метки. По количеству метки определяют количество антитела и соответственно количество белка X. Этот метод отличается большой чувствительностью.

Иммуноферментный анализ используется для определения ксе­ нобиотиков, природных лекарственных веществ, индивидуальных бел­ ков. Метод заключается в том, что фермент, связанный с антигеном или антителом, выступает в качестве индикатора Высокоспецифической ре­ акции антиген - антитело. Например, для определения количества инсу­ лина в исследуемой жидкости вначале иммунизируют животное и полу­ чают к инсулину антитела. Их связывают с нерастворимым носителем. К инсулину (как антигену) «пришивают» фермент. В исследуемую жид­ кость, содержащую инсулин, количество которого нужно определить, вносят точное количество инсулина, связанного с ферментом. Эту жид­ кость пропускают через носитель с антителами. Оба инсулина конку­ рируют за места связывания с иммобилизованными антителами, flo ферментной реакции определяют количество инсулина, «сшитого» с ферментом и связавшегося с антителами или оставшегося в растворе, рассчитывают количество свободного инсулина в анализируемой жид­ кости.

Методы выделения белков из тканей и получение индивидуальных белков

Выделение и очистка белков - одна из самых сложных проблем белковой химии, так как в биологических объектах обычно присутст­ вуют смеси большого количества белков часто с близкими характери­ стиками их физико-химических свойств. Трудности выделения и очист­ ки белков обусловлены также неустойчивостью белков, их высокой чувствительностью к повышению температуры, к действию химических реагентов, что может вызвать денатурацию. Поэтому весь процесс вы­ деления проводят при возможно низких температурах.

Выделение белков включает следующие этапы:

•Разрушение ткани и гомогенизация: " В ступке на холоду.

С помощью гомогенизаторов: с вращающимися ножами, пестико­

39

вых с притертыми поверхностями (стеклянные, тефлоновые пестики), где измельчение происходит между двумя поверхностями. Последние позволяют выделять неповрежденные отдельные структуры клеток - яд­ ра, митохондрии.

-Путем попеременного замораживания и оттаивания.

-Ультразвуком (но необходимо подбирать режим: частоту колеба­ ний, мощность источника).

-Шаровыми или валковыми мельницами.

2.Экстракция белков:

Проводится водой, растворами нейтральных солей (NaCl, КС1 - 10%), буферными растворами (фосфатным, цитратным, боратным, ве- ронал-мединаловым, трис - триоксиметил-аминометан и его соли с НС1). При этом учитывается ионная сила растворов, подбираются зна­ чения pH, t°, продолжительность извлечения.

Извлечение белков также проводят органическими растворителя­ ми: глицерином, растворами сахарозы, спирта различной концентрации.

Выбор экстрагента проводится с расчетом наиболее полного из­ влечения.

3.Осветление раствора: путем фильтрования или центрифугирования.

4.Разделение экстрагированных белков основано на различиях в рас­ творимости белков, в размерах, массе и др.

Высаливание - метод, основанный на различиях в растворимо­ сти. Высаливание —это выделение белков из раствора путем прибавле­ ния нейтральных солей щелочных или щелочноземельных металлов. Ме­ тод основан на разрушении солями (обладающими водоотнимающими свойствами) гидратной оболочки —фактора устойчивости белковых мо­

лекул в растворе. Белки, осажденные этим способом, могут вновь легко растворяться в воде.

Классический пример разделения белков методом высаливания —

осаждение альбуминов и глобулинов сульфатом аммония. Глобулины осаждаются полунасьпценным, а альбумины - насыщенным раствором соли. Но это метод группового разделения, так как осаждаются белки с близкими физико-химическими характеристиками.

Более тонкое разделение получают растворами спирта разной концентрации.

На различиях в молекулярной массе основан методу//ьтрацентрифугирования. В ультрацентрифуге (сконструирована в 1925 году Т. Сведбергом) скорость вращения ротора составляет от 75000 до 150000 об/мин. Центробежная сила превышает силу земного притяже­ ния в 500000 раз, и создается такое центробежное ускорение, которое необходимо для осаждения небольших белковых молекул. Белки с раз­ ной массой движутся ко дну пробирки с разной скоростью, при этом между слоем жидкости, содержащей белок, и слоем, освободившимся от

40