Методи одержання антибіотиків

Мікробіологічний синтез на основі плісняв (Penicillium) (біосинтез пеніцилінів, деяких протипухлинних і противірусних антибіотиків) або променистих грибів (Streptomyces) (стрептоміцин та інші антибіотики-глікозиди, тетрацикліни, макроліди, полієнові антибіотики). Бактерії роду Bacillus продукують більшість антибіотиків- поліпептидів.

Хімічний синтез (левоміцетин з п-нітроацетофенону).

Поєднання мікробіологічних і хімічних методів.

Добувають напівсинтетичні антибіотики на основі трансформації молекул природних антибіотиків (напівсинтетичні тетрацикліни, пеніциліни, цефалоспорини та ін.

Основні етапи мікробіологічного синтезу:

а) підбір високопродуктивних штамів продуцентів;

б) підбір живильного середовища (рН, солі металів, вуглеводи, жири);

в) процес ферментації (біосинтезу);

г) виділення і очистка антибіотика (кристалізація, хроматографія, екстрагування, переосадження).

Рис. Колонії актиноміцетів,

які утворюють антибіотики, на поверхні агаризованного

живильного середовища.

Методи аналізу антибіотиків

Для ідентифікації антибіотиків використовують різні кольорові реакції на відповідні функціональні групи; спектральні характеристики в різних областях спектра; хроматографічні методи.

Для кількісного визначення антибіотиків використовують біологічні, хімічні, фізико-хімічні методи (спектрофотометрія, фотоколориметрія, рідинна хроматографія).

Розроблено спосіб, який поєднує фізико-хімічний і біологічний підходи до оцінки активності ЛЗ. Метод базується на лазерній дифракції (залежність кута розсіювання світла від розміру частинок) в середовищі, яке містить клітини мікроорганізмів при дії на них антибіотиків.

Кількісне визначення антибіотиків мікробіологічним методом (ДФУ)

Активність антибіотиків визначають шляхом порівняння ступеня пригнічення росту чутливих (тест- культур) м/о у результаті дії випробовуваного антибіотика і стандартного зразка у відомих концентраціях. Кількісне визначення проводять

дифузним або турбідиметричними методами. Розрахунок біологічної активності проводять за стандартною кривою, заздалегідь побудованою на основі результатів визначення п'яти концентрацій стандартного зразка антибіотика. Біологічна активність виражається в одиницях дії (ОД).

Дифузний метод оснований на здатності молекул антибіотиків дифундувати в агарному середовищі. Оцінюється розмір зони, в якій використовувані тест- організми не розвиваються. Цей розмір залежить від хімічної природи антибіотика, його концентрації, рН і складу середовища, температури експерименту.

Турбідиметричний метод базується на вимірюванні інтенсивності світла, яке поглинається завислими частинками – клітинами мікроорганізмів. При додаванні певних кількостей антибіотика спостерігається затримка росту клітин мікроорганізмів, а потім їх загибель. При цьому зменшується інтенсивність поглинутого світла. В якості альтернативного турбідиметрії методу можна використати нефелометричний метод кількісного аналізу за інтенсивністю світла, розсіяного мікроорганізмами.

ОД – це величина, якою виражається біологічна активність антибіотиків. За ОД приймається мінімальна мольна кількість антибіотика, яка пригнічує розвиток тест-мікроорганізму в певному об'ємі живильного середовища. Кількість грамів діючої речовини в ОД для різних антибіотиків різна.

Середнє значення активності, знайдене біологічним методом, дещо нижче, ніж теоретична активність. У фармакопейних статтях наводиться значення теоретичної активності і нижня допустима межа активності досліджуваного антибіотика, ОД/мг.

Встановлено, що 1 мг чистого стрептоміцину еквівалентний 1000 ОД Відповідно 1 ОД стрептоміцину еквівалентна 1 мікрограму (1 мкг) чистої основи стрептоміцину. Для інших антибіотиків ОД відрізняється від 1 мкг речовини. Наприклад для бензилпеніциліну 1 ОД еквівалентна = 0,6 мкг, тому 1 мг антибіотика містить 1667 ОД.

Сучасні методи біологічного визначення активності антибіотиків в біологічних рідинах:

1). Модифікований метод дифузії в агар. Створюються максимально сприятливі умови для росту тест-м/о.

2). Уреазний. Базується на запобіганні зміні рН живильного середовища в процесі росту тест-м/о.

3). Ферментативний. Оснований на інактивації аміноглікозидів в крові специфічними ферментами (аденілтрансфераза і ацетилтрансфераза), які продукуються грамнегативними м/о, стійкими до антибіотиків даної групи.

4). Радіоімунний. Оснований на порівняльній оцінці конкуренції антибіотика, міченого тритієм, і досліджуваного антибіотика у відношенні до специфічних антитіл імунної сироватки.

Дослідження стерильності антибіотиків (ДФУ)

Проводять підбір живильного середовища і перевірку придатності методики випробування. Визначення стерильності проводять використовуючи метод мембранної фільтрації або метод прямого висівання. Незалежно від методу випробування проводять відповідний негативний контрольний дослід, використовуючи зразки, стерильність яких була доведена раніше. Посіви переглядають періодично під час і після закінчення інкубаційного періоду, відмічаючи наявність візуально виявлюваного росту м/о. Якщо випробовуваний зразок викликає помутніння живильного середовища, що робить неможливим візуальний облік, то через 14 діб після початку інкубації з кожної посудини переносять певну кількість середовища в посудини з тим самим живильним середовищем. Продовжують інкубацію вихідних і повторних посівів. Загальний час інкубації – 14+7 діб від початку випробування. Лікарський засіб вважається стерильним , якщо при візуальному обліку не виявляється ріст м/о.

Дослідження аномальної токсичності антибіотиків

1.Кількість мишей - 5

2.Маса мишей - 17-24 г

3.Спосіб введення – внутрішньовенно розчин вводять від 15 с до 30 с, якщо немає інших

зауважень. Час спостереження 24 години, або протягом часу згідно вимог окремої статті.

4.Зразок витримує випробовування, якщо жодна з мишей не загине протягом часу зазначеного в окремій статті. У випадку загибелі 1 тварини випробовування знову повторюють. Зразок витримує випробовування якщо жодна з тварин у 2-й групі не загинула.

Дослідження пірогенності антибіотиків (ДФУ)

1. Кількість кролів - 3

2. Маса кролів не менше 1,5 кг

3. Спосіб введення - у вушну вену, розчин вводять 4 хв, об’єм, який вводиться має бути не менше як 0,5 мл і не більше 10 мл на 1 кг ваги

4. Випробування проводиться спочатку на 3 кролях. Зразок витримує дослідження, якщо сумарне підвищення т-ри не перевищує 1,15 С, якщо підвищення т-ри становить 1,15 С, але не більше 2,65 С, дослідження повторюють. Тоді відповідні значення т-р становлять 2,8 С; і 4,3 С. Якщо сумарне збільшення є більшим 4,3 С. Зразок бракують. Якщо необхідно дослідження проводять ще на 3(6) кролях.