Учебник

4. В лунку добавляется субстратно-хромогеный реагент, который под влиянием фермента конъюгата, связавшегося с иммунными комплексами,

превращается в окрашенный продукт реакции.

Рис. 2.9. Этапы неконкурентного ИФА

«Сэндвич» – разновидность неконкурентного гетерогенного ИФА;

метод широко используется для определения АТ и АГ (рис. 2.10):

1. На твердой поверхности пластиковой лунки сорбированы антитела (АТ). В лунку вносится исследуемый биологический материал,

чаще всего сыворотка или плазма крови больного.

2.Исследуемые антигены (АГ) в ходе инкубации связываются с АТ,

сорбированными на планшете. Несвязавшиеся компоненты удаляют

отмыванием.

3.В лунку вносят конъюгат, который представляет собой антитела,

меченые ферментом. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то конъюгат соединяется с определяемыми антигенами и образуется тройной комплекс – «сэндвич».

Несвязавшаяся часть конъюгата остается в жидкой фазе и удаляется отмыванием.

121

4. В лунку добавляется субстратно-хромогеный реагент, который под влиянием фермента конъюгата превращается в окрашенный продукт реакции.

Количество тестируемых антигенов оценивают по содержанию окрашенного продукта реакции, строят калибровочную зависимость и проводят определение концентрации тестируемых антигенов в образцах пациентов. Концентрация определяемого вещества прямо пропорциональна

интенсивности окраски пробы и, следовательно, оптической плотности.

По аналогичной схеме работают тест-системы для определения АТ, но в качестве иммуносорбента в них используются АГ, а конъюгат содержит раствор АГ, меченых ферментом.

Рис. 2.10. « Сэндвич». Последовательность анализа

Тест-системы с использованием стрептавидина и биотинилированных моноклональных антител получили распространение для усиления аналитических характеристик тест-систем. В этом случае стандарты,

контроли и пробы пациентов сначала добавляются в микроячейки, покрытые стрептавидином. Затем добавляют биотинилированные АТ (это смесь высокоочищенных специфичных моноклональных АТ к различным эпитопам), фермент-меченые АТ (конъюгат), и реагенты перемешиваются.

Результатом реакции между различными антителами и определяемым антигеном становится образование «сэндвич»-комплекса, который

122

связывается со стрептавидином в ячейках. Несвязавшиеся компоненты удаляются промывкой. Особенностью таких систем является отдаление ферментной реакции от стенки планшета, поэтому окраска развивается в объеме и тест-система аналитически становится более чувствительной.

Конкурентный гетерогенный иммуноферментный анализ cхематично представлен на рис. 2.11. В этом случае определяемые АГ или АТ пациента конкурируют с аналогичными мечеными АГ или АТ конъюгата за места связывания с иммуносорбентом.

Рис. 2.11. Конкурентный иммуноанализ

Последовательность анализа:

1.На поверхности планшета сорбированы АГ. В лунку вносят исследуемую сыворотку или плазму пациента и конъюгат, который представляет собой антитела, меченые ферментом..

2.В ходе инкубации АТ пациента конкурируют с мечеными АТ конъюгата за места связывания с иммуносорбентом, в результате образуются иммунные комплексы двух видов: содержащие ферментную метку (меченые)

ибез нее (немеченые). Чем больше определяемых антител содержит образец пациента, тем меньше образуется меченых иммунных комплексов.

Несвязавшийся конъюгат остается в жидкой фазе и удаляется отмыванием.

123

3. В лунку добавляется бесцветный субстратно-хромогенный реагент,

который под влиянием фермента превращается в окрашенный продукт реакции. При конкурентном варианте концентрация определяемого вещества

обратно пропорциональна оптической плотности. Анализ этого типа часто используют для определения антигенов, присутствующих в высоких концентрациях, или гормонов, которые имеют только один антигенсвязывающий центр.

Качественный анализ часто используется при проведении скрининговых исследований и диагностике инфекционных заболеваний. Как правило, для диагностики инфекций используются два вида серологических реакций:

1. Обнаружение патоген-специфических антител в сыворотке крови обследуемого;

Установление родовой и видовой принадлежности микроорганизма или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

Люминесценция. Люминесценция – это излучение света молекулами.

В процессе люминесценции происходит отдача энергии. Примером природной люминесценции является свечение термофильных растений вблизи гейзеров. Люминисценция может происходить при передаче энергии

вразличных процессах. В медицинской лабораторной практике наиболее широко нашло применение флуоресценция – свечение после облучения ультрафиолетовым или видимым светом, и хемилюминесценция – излучение

врезультате химической реакции.

Флюоресценция получила свое название от природного минерала – флюорита CaF2, у которого впервые наблюдалось этот тип свечения.

Различают фосфоресценцию – свечение, продолжающееся относительно долго после прекращения воздействия, и флюоресценцию – свечение,

происходящее только во время воздействия. Возбуждение происходит при большей энергии, то есть при меньшей длине волны, чем вторичное

124

свечение. Поэтому при флюоресценции длина волны свечения больше, чем длина волны возбуждения. В аналитических целях в тест-системах в качестве меток при проведении флюофесцентного анализа часто используются флюорофоры. В клинической лабораторной диагностике широко применяются различные модификации метода иммунофлюоресценции.

Иммунохемилюминисценция. Хемилюминесценция – испускание света молекулами, перешедшими в возбужденное состояние в результате химической реакции. Чаще всего данное явление наблюдается при окислении органических веществ перекисью водорода, гипохлоритом, молекулярным кислородом. В люминометрах характерной особенностью является отсутствие источника света, свечение образца индуцируется химической реакцией.

Принцип хемилюминесцентной детекции реализуется в вариантах методик иммунохимических исследований. Хемилюминесцентная детекция обладает высокой специфичностью, не требует длительных инкубаций или добавления стоп реагента, не использует дополнительные источники света.

Хемилюминесценция в настоящее время активно используется в КДЛ и научной практике для обнаружения минимальных количеств аналитов в биопробах. В состав реакционной смеси при реакции иммунохемилюминесценции (ИХЛ) входят: меченые антитела или антигены и смесь: хемилюминесцентный субстрат, перекись водорода и усилители реакции. В качестве последних применяются ароматические амины,

нафтолы, фенолы. Иммунохимические анализаторы, разработанные для регистрации ИХЛ, обладают высокой производительностью и способностью проводить анализ в автоматическом режиме. К несомненным достоинствам иммунохемилюминесцентного метода отнесятся:

Высокая автоматизация и стандартизация аналитического процесса.

Высокая аналитическая чувствительность и специфичность.

Длительная стабильность реагентов.

Возможность исследования единичных проб.

125

Сравнительная характеристика фотометрических методов. В

клинической химии достаточно часто встает вопрос о выборе технологии для определения той или иной группы аналитов. Например, определение гормонов можно проводить методом абсорционной фотометрии по технологии ИФА-анализа, можно турбидиметрией и нефелометрией, можно воспользоваться технологиями, основанными на использовании флюоресцентной или люминесцентной метки. Основным недостатком абсорбционной фотометрии является относительно узкий линейный диапазон измерения результатов. Даже лучшие фотометры позволяют регистрировать изменения аналитов (гормонов) не более, чем в пределах 4 десятичных порядков. Флюоресцентные и люминесцентные технологии увеличивают линейный диапазон до 6-8 десятичных порядков, то есть позволяют работать без разведения. В табл. 2.2 представлены сравнительные данные о чувствительности фотометрических, флуоресцентных и люминесцентных методов определения гормонов (и других аналитов). Флуоресцентные и люминесцентные технологии позволяют существенно увеличить чувствительность определения веществ в биопробах, однако они используются, как правило, в закрытых технологиях, включающих прибор-

реактивы-калибраторы-контрольные материалы.

Аналитические характеристики, такие как линейный диапазон и чувствительность, определили, что методы абсорбционной фотометрии,

реализованные на биохимических анализаторах, применяются в основном как скрининговые диагностические технологии, выявляющие системную патологию. Иммунохимические методы, основанные на специфическом взаимодействии антитело-антиген, используются для выявления или количественного определения конкретных маркеров, которые могут указать на наличие определенного заболевания или патологии. Качественные иммунохимические методы, реализованные технологией ИФА-анализа, чаще применяются при диагностике инфекционных заболеваний, при котором важен ответ на вопрос «есть или нет» заражение, «есть или нет» иммунитет к

126

конкретному инфекционному агенту. Количественные иммунохимические методы используются для определения концентрации индивидуальных молекул, что позволяет оценить степень патологии, следить за эффективностью терапии, констатировать излечение. В случаях повышения метки, характеризующей патологию, эффективны менее чувствительные иммунохимические технологии: иммунотурбидиметрия, нефелометрия. Если же количество метки снижается или требуется получить воспроизводимый результат в отдаленный период, то предпочтительно использовать иммунохемилюминесцентные технологии.

Таблица 2.2

Сопоставление методов применительно к гормональным исследованиям

Микроскопическое исследование – один из наиболее используемых методов в лабораторной гематологии, цитологии, общеклинических исследованиях. С

помощью микроскопов объекты исследования размером от 0,5 мкм с разрешением элементов до 0,1 мкм могут быть увеличены более чем в

1500 раз. Световые микроскопы делятся на микроскопы плоского поля

(двухмерное изображение) и стереоскопические (объемное изображение). И

127

те и другие подразделяются на микроскопы проходящего света микроскопы отраженного света. Микроскопы походящего света плоского поля в отечественной практике называют биологическими.

Косновным параметрам микроскопа относятся: увеличение,

разрешающая способность, линейное поле на предмете, степень исправления аберраций.

Увеличение микроскопа зависит от увеличения объектива, окуляра,

промежуточных насадок. Например, в отечественном микроскопе Микмед 1

монокулярная насадка не имеет увеличения, поэтому общее увеличение с объективом 100× и окуляром 10× будет равно 1000×. Апертура объектива – это максимальный угол, под которым лучи, идущие от препарата, могут попадать в объектив. Числовая апертура определяет ряд важнейших свойств микроскопа: яркость изображения, глубину резкого видения, степень сходства изображения с предметом. Увеличение числовой апертуры повышает способность объектива воспроизводить мелкие детали объекта.

Объективы проходящего света, работающие в воздухе (сухие системы)

имеют числовую апертуру не выше 0,95. Иммерсионные объективы имеют числовую апертуру до 1,45. Числовая апертура объективов маркируется на корпусе, например, надпись «40×/0,95» означает, что объектив с увеличением

40× и числовой апертурой 0,95.

Полезное увеличение микроскопа должно быть не более 1000 числовых апертур объектива и не менее 500. Более высокое увеличение или меньше меньшего не выявляет новых деталей объекта в изображении. Например, для объектива 100× с числовой апертурой 1,25 полезное увеличение микроскопа лежит диапазоне 626-1250×. При большем увеличении изображение становится нечетким и малоконтрастным, с пониженной разрешающей способностью. При меньшем увеличении изображение объекта, несмотря на четкость и повышенный контраст, становится настолько мелким, что элементы объекта практически неразличимы.

128

Разрешающая способность – это наименьшее расстояние между изображениями 2 соседних точек (линий), которые различаются как 2

отдельных изображения.

Поле на предмете рассчитывается учетом линейного поля окуляра и увеличения объектива, а также дополнительных оптических элементов,

которые умеют увеличение и расположены до окуляра внутри микроскопа.

Так микроскоп Микмед 1 с объективом 100× и бинокулярной насадкой,

дающее дополнительное увеличение 1,5× имеет размер линейного поля

0,12 мм.

Аберрация – это искажение или отступление в изображении объекта от идеального. Хроматические аберрации обусловлены различным преломлением света с разными длинами волн. При этом образуются в каждом цвете отдельные изображения, в результате изображение объекта имеет вид «слоеного пирога». Хроматические аберрации устраняются с помощью подбора марок стекол с учетом показателя преломления и дисперсии, технологии изготовления радиусов и других технологических приемов.

Особенности микроскопических методов при микробиологических

Микроскопическое исследование с использованием люминесцентного микроскопа. Люминисцентные микроскопы проецируют на объект отраженный свет определенной длины волны, который заставляет часть объекта светиться на другой длине волны. Визуально изображение,

сфокусированное люминисцентным микроскопом, представляет собой ярко светящиеся объекты на черном фоне. При микроскопии возможна визуальная оценка антигенных структур клеток и тканей, а также микроорганизмов. При этом происходит связывание специфически меченных флюорохромом антител с изучаемыми клеточными или тканевыми антигенами микропрепарата.

129

Варианты метода при учете результатов с помощь люминесцентного микроскопа в различных модификациях под разными названиями – реакция иммунофлюоресценции (РИФ), прямой иммунофлюоресцентный анализ

(ПИФ), метод флуоресцентного анализа (МФА) — широко применяются в настоящее время.

Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов и быстротой получения ответа. Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав диагностического набора. На поверхность фиксированного мазка наносят меченные флоуоресцеинизотиоцианатом сыворотки или моноклональные антитела.

Выделяют прямую и непрямую иммунофлюоресценцию.

Прямой иммунофлюоресценцией тканевые антигены, инфекционные агенты или отложения сывороточных белков в тканях или клетках обнаруживаются с помощью меченных флюорохромами антисывороток или моноклональных антител. Прямая иммунофлюоресценция используется преимущественно для морфологических исследований биопсий ткани,

цитологических и микробиологических исследований. В диагностике аутоиммунных заболеваний метод прямой иммунофлюоресценции используется для обнаружения отложений иммуноглобулинов и факторов комплемента в биопсиях кожи и почек.

Непрямая иммунофлуоресценция относится к тестам, в которых применяются для обнаружения антигенов флуоресцентномеченные антитела.

Криосрезы ткани, клетки или микроорганизмы используются как «субстрат»,

с которым связываются меченные аутоантитела. В результате с помощью люминесцентного микроскопа можно описать разные типы свечения. Так антинуклеарные антитела могут быть направлены как к антигенам

130