Учебник

нуклеохроматина, который диффузно распределен в ядре, так и к компонентам ядрышка. Для того чтобы различить эти варианты выявления антинуклеарных антител, наряду с титром антинуклеарного фактора,

описывается «тип свечения» ядра клетки. Типы свечения могут быть описаны при выявлении антинейтрофильных антител, антикератиновых антител, антимитохондриальных антител и многих других. Несомненным преимуществом непрямой иммунофлуоресценции является возможность оценки одновременного связывания аутоантител со всем разнообразием антигенов, которое имеется в тканевом субстрате. Это делает иммунофлуоресценцию удобной для скринингового использования и обуславливает большое значение этого метода в аутоиммунной диагностике.

Возможно проведение всех стадий иммунофлуоресцентного анализа в полностью автоматическом режиме. Встроенная в микроскоп камера делает снимки высокого разрешения и автоматически сохраняет их в базе данных.

Предварительная оценка результатов (положительный или отрицательный)

происходит автоматически.

Инвертированные микроскопы. По расположению объектива относительно препарата и источника света микроскопы бывают прямые и инвертированные. Инвертированные микроскопы проходящего света представляют собой «перевернутую» конструкцию обычного микроскопа :

осветитель проходящего света расположен над объективом и имеет большое рабочее расстояние, тем самым беспечивается свободный доступ инструмента (манипулятора, иглы, пипетки) к препарату, который находится,

например, в чашке Петри. При применении фозовоконтрастных устройств,

конденсоров темного поля и косого освещения возможно наблюдение малоконтрастных препаратов.

Метод темного поля. Используют метод при исследовании малоконтрастных объектов, которые невозможно покрасить. Метод основан на эффекте, который достигается освещением объекта полым конусом света,

внутренняя апертура которого превосходит числовую апертуру

131

применяемого объектива. Таким способом достигается эффект, что ни один прямой луч не попадает в объектив (темное поле). При наличии объекта будет наблюдаться яркое блестящее свечение контура вокруг объекта на темном фоне в отраженном свете. Метод применяется для наблюдения живых леток. Микроорганизмов, прозрачных кристаллов и других элементов,

когда достаточно наблюдать контур.

Метод фазового контраста. Метод позволят увидеть элементы внутренней структуры прозрачного объекта. Фазово-контрастное устройство дает возможность преобразовывать фазовые изменения световых волн,

проходящих через объект, в амплитудные. В результате прозрачные объекты становятся видимыми.

Цитохимические исследования. Цитохимические методы представляют собой достаточно простые, воспроизводимые, не требующие сложной аппаратуры методики. Цитохимические исследования позволяют изучить ферментативную активность, содержание различных веществ в клетках крови, костного мозга, лимфатических узлов и других тканей, позволяют выявлять направленность дифференцировки кроветворных клеток.

Цитохимические реакции выполняют на мазках, на предметных стеклах,

применяя соответствующую фиксацию и докрашивание клеток. Оценка результатов в большинстве случаев ограничивается определение реакции – слабая, умеренная, интенсивная.

Основой идентификации клеток служат особенности метаболизма,

специфичные для каждого типа клеток. Например, миелопероксидаза ,

являющаяся лизосомальным ферментом, локализуется преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и является маркером клеток миелоидного ряда. Липиды обнаруживаются практически во всех лейкоцитах, за исключением лимфоцитов. Однако основная масса липидов связана с клетками гранулоцитарного ряда.

Определение неспецифической эстеразы используется для идентификации лейкозных моноцитарных предшественников. Определение активности

132

щелочной фосфатазы применяют для дифференцировки хронического миелолейкоза от других миелопролиферативных заболеваний и реактивных состояний. Окраска на кислую фосфатазу используется для выделения волосато-клеточного лейкоза из группы лимфопролиферативных заболеваний.

Иммунноцитохимические исследования. Иммуноцитохимическими называют методы микроскопического выявления и идентификации молекулярных компонентов клеток, основанные на реакции антиген-

антитело. Иммуноцитохимическое исследование – это комбинация цитологического и иммуноферментного методов. При постановке иммуноцитохимических методов требуется, прежде всего, так фиксировать исследуемый клеточный материал, чтобы в клетках сохранялась нативность выявляемых антигенов. Пероксидаза хрена в присутствии небольшого количества перекиси водорода катализирует окисление

3,3'-диаминобензидина с образованием нерастворимого золотисто-

коричневого продукта. Если пероксидазу непосредственно или опосредовано присоединить к антителам, то эта реакция может происходить только там,

где меченные ферментом антитела связались с антигеном. При микроскопии окрашенных препаратов на фоне обычной цитологической картины,

например костного мозга, можно идентифицировать коричневый продукт ферментативной реакции, образовавшийся в местах связывания использованных антител с выявляемыми антигенами. Иммуноферментное маркирование можно осуществлять при помощи комплекса щелочная фосфатаза-антитела к щелочной фосфатазе. Конечный продукт ферментативной реакции имеет хорошо заметный красивый красный цвет.

Ионоселективный анализ. Ионоселективный анализ – один из наиболее широко используемых методов клинической биохимии. Он основан на использовании ионоселективных электродов, которые представляют собой электрохимические системы, формирующие потенциал в растворе электролита,

зависящий от концентрации ионов. С помощью ионоселективных электродов

133

определяется активность ионизированных молекул. Ионы, связанные с белками, другими анионами и находящиеся в комплексе, не регистрируются ионоселективными электродами, т.е. общая концентрация микроэлемента не регистрируется. Это важно, так как биологически активными являются именно ионизированные молекулы. В клинической биохимии широко определяемыми катионами являются Н+ (pH), К+, Na+, Ca2+, Mg2+, Li+ и анион Cl-.

Основным элементом ионоселективного электрода является мембрана,

проницаемая только для определенного иона. Состав мембраны подбирается на производстве. В стеклянных электродах формируется кристаллическая решетка, ячейки которой чувствительны к тестируемому иону. В

мембранных электродах в состав полимера вводится индуктор проводимости для соответствующего иона, который формирует каналы специфической проницаемости. В частности в мембрану для определения активности К+

часто вводится валиномицин, Na+ – нистатин. К достоинствам ионоселективных электродов относятся: возможность прямого измерения активности при контакте электрода с биологической жидкостью,

портативность и минимальный объем биожидкости (микролитры), быстрый ответ, что позволяет использовать метод при неотложных состояниях.

Анализаторы ионоселективные измеряют активность ионов в сыворотке, плазме, цельной крови, диализатах, моче. Минимальный объем пробы 100 мкл. Как правило, диапазон измеряемых концентраций в сыворотке, плазме, цельной крови: К+ 0,2-40.0 ммоль/л; Na+. 20.0-200.0

ммоль/л; Ca2+ 0.10-6.00 ммоль/л; рН 6.0-8.0 ед. рН; Cl- 25.0-200.0 ммоль/л.

Разрешение: К+ 0.01 ммоль/л; Na+ 0.1 ммоль/л; Ca2+ 0.01 ммоль/л; рН 0.001

ед. рН; Cl- 0.1 ммоль/л. Диапазон измерения и чувствительность вполне достаточны для измерения активности ионов в крови в норме и при патологии.

Анализ газов крови и гемоксиметрия. Газообмен в человеческом

организме выполняет две основные функции:

134

1.Выведение из организма диоксида углерода, образующегося в результате катаболизма.

2.Обеспечение тканей и органов адекватным количеством кислорода,

который является необходимым акцептором электронов цепи тканевого дыхания.

Кислород и СО2 транспортируются между альвеолами и тканями в противоположных направлениях, и соответствующие парциальные давления этих газов в крови не всегда изменяются пропорционально. Этот факт объясняется следующим образом: во-первых, диоксид углерода обладает большей способностью к диффузии, чем кислород. Это приводит к тому, что,

например, при интерстициальном отеке легких развивается нарушение диффузии кислорода в кровь, а следовательно и гипоксемия в то время как уровень рСО2 сохраняется в норме. Во-вторых, кислород переносится от легких к тканям главным образом в связи с гемоглобином и очень небольшое количество О2 находится в виде физически растворенного в крови. В

артериальной крови гемоглобин практически полностью насыщен кислородом и гипервентиляция, таким образом, может приводить к выраженной гипокапнии, незначительно увеличивая при этом значения рО2.

Транспорт СО2 обеспечивается за счет растворения в плазме и формирования бикарбонатной буферной системы и практически не связан с гемоглобином.

Концентрация углекислого газа в крови находится в большей

зависимости от уровня вентиляции легких, чем содержание кислорода.

Транспорт диоксида углерода. Транспорт кровью, диффундирующего из тканей диоксида углерода, осуществляется в двух фазах: в плазме крови

(внеклеточная фаза) и в эритроцитах (клеточная фаза). Как в плазме, так и в эритоцитах СО2 транспортируется в основном в 2 транспортных формах:

Суммировать процессы, происходящие в эритроцитах, можно следующим образом: СО2, образующийся в тканях, поступает в эритроциты,

где из него синтезируется угольная кислота, которая диссоциирует с образованием гидрокарбонат-иона и иона водорода. Ионы водорода связываются со свободным гемоглобином. Гидрокарбонат диффундирует из эритроцитов в плазму в обмен на анионы хлора. В легких идет обратная реакция. Восстановленный гемоглобин окисляется с образованием оксигемоглобина и ионов водорода, последние, связываясь с гидрокарбонатом, образуют угольную кислоту. Н2СО3 диссоциирует с образованием диоксида углерода и воды. СО2 диффундирует в альвеолы и выводится в окружающую среду.

Определение СО2. При анализе газов крови с диагностической целью измеряется парциальное давление газообразного СО2, растворенного в крови

– рСО2. Для этого используется рСО2-электрод, который состоит из стеклянного электрода для измерения рН, отделенного от исследуемого раствора мембраной, селективно проницаемой для диоксида углерода.

Пространство между стеклянной мембраной и проницаемой для СО2

мембраной заполнено раствором хлорида и гидрокарбоната натрия. Диоксид углерода, физически растворенный в пробе, диффундирует в электролитный раствор NaCl и NaHCO3, где происходит образование угольной кислоты и диссоциация ее с образованием протона. В результате изменение рН электролитного раствора находится в линейной зависимости от диффундирующего СО2 и регистрируется стеклянным электродом.

Линейность измерений для рСО2-электродов находится в диапазоне от 8 до

200 мм.Hg парциального давления диоксида углерода.

Транспорт кислорода. Как и диоксид углерода кислород в крови может находиться в двух фазах:

1.Растворенный в плазме крови (внеклеточная фаза);

2.Оксигемоглобин эритроцитов (клеточная фаза).

136

В 100 мл крови здорового человека, который дышит воздухом,

содержится 0,3 мл растворенного кислорода, что несоизмеримо мало с потребностями организма. Количество потребляемого тканями кислорода в состоянии покоя составляет около 250 мл/мин.

Гемоглобин – это одно из наиболее значимых биохимических соединений. Он позволяет объему цельной крови связывать в 65 раз больше кислорода, чем такой же объем плазмы. Более того, связь кислорода с гемоглобином – обратима. График зависимости степени насыщения гемоглобина кислородом (НbО2) от парциального давления кислорода в крови (РаО2, Hg), называемый кривой диссоциации оксигемоглобина,

иллюстрирует процесс образования и диссоциации оксигемоглобина (рис. 2.12). Кривая, характеризующая эту зависимость, имеет S-образный вид.

Степень насыщения гемоглобина (sO2) кислородом определяется согласно формуле:

sO2 ,% количество О2 , вязанного с Hb 100 кислородная емкость Hb

Кислородная емкость гемоглобина – максимальное количество кислорода, способного соединиться с Нb. 1 грамм гемоглобина теоретически может присоединить 1,39 мл О2. При РаО2 = 100 мм Hg гемоглобин насыщен кислородом на 97,5%. Дальнейшее увеличение РаО2 приводит к росту sO2

лишь на 0,3%. Нижний сегмент кривой характеризует процесс диссоциации оксигемоглобина. При 40 мм Hg гемоглобин насыщен кислородом на 75%, а

при РО2 10 мм Hg – только на 10%.

Измерение рО2. Ключевым показателем при оценке метаболизма кислорода является парциальное его напряжение – рО2. Этот показатель прослеживается при определении кислорода в воздухе, плазме крови,

тканевой жидкости. Измеряется рО2 амперометрически при помощи электрода Кларка. Он состоит из тонкой платиновой проволоки (катод,

вплавленный в стеклянный цилиндр) и Ag/AgCl проволоки (анод,

референтный), которые погружены в раствор фосфатного буфера и КCl. О2

137

диффундирует через полупроницаемую мембрану в раствор электролита, где он восстанавливается на катоде. Сила образующегося при этом электрического тока пропорциональна величине рО2 в исследуемом образце.

Параметр Р50 характеризует сродство гемоглобина к кислороду. Эта величина определяет парциальное давление кислорода в крови, при котором происходит 50% насыщение гемоглобина кислородом. У человека при 37оС,

рН крови = 7,4, рСО2 = 40 мм Hg и Нb = 150 г/л, Р50 составляет в среднем 26,8

мм Hg (3,6 кПа). Если сродство гемоглобина к кислороду увеличивается, то кривая диссоциации смещается влево и Р50 уменьшается. При этом гемоглобин хорошо связывает кислород в легких, но плохо отдает его тканям. В случае уменьшения сродства гемоглобина кривая диссоциации смещается вправо, Р50 увеличивается, при этом снижается способность гемоглобина связывать кислород в легких, но облегчается освобождение кислорода в тканях.

Рис. 2.12. Кривая диссоциации оксигемоглобина в норме

Молекулярно-генетические методы анализа. Молекулярная диагностика в лабораторных исследованиях занимается выявлением патологий, изучением их причин и механизмов развития на молекулярном уровне. Преимущество подхода заключается в том, что он дает возможность выявить склонность к тому или иному заболеванию задолго до его

138

клинических проявлений, вовремя принять профилактические меры,

предотвратив его развитие или облегчив его течение, и, с учетом индивидуальных особенностей, применять терапию. Среди молекулярно-

генетических технологий наиболее широко применяются в диагностической практике методы для выявления известных эндогенных и экзогенных ДНК последовательностей, которые можно разделить на два класса:

гибридизационный анализ нуклеиновых кислот и амплификационные методы.

Гибридизационный анализ. В основе метода лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации – образованию двухцепочечных структур за счет взаимодействия комплементарных последовательностей нуклеотидов. Различают два типа гибридизационного анализа:

методы гибридизационного анализа, проводимые в растворе

(гомологичные);

методы гибридизационного анализа, проводимые на твердом носителе (гетерогенные).

Последние получили более широкое распространение в связи с тем, что имеют большую аналитическую чувствительность и специфичность,

являются более технологичными, их проще стандартизовать и автоматизировать.

Принцип метода основан на гибридизации зонда на твердой поверхности. В качестве твердой поверхности чаще всего используют полимерную нейлоновую мембрану. Анализ состоит из следующих стадий:

пробоподготовка (выделение ДНК из образца);

фиксация ДНК образца на мембране;

гибридизация с ДНК-зондом, меченным флюорофором или ферментом;

детекция результата.

139

В лабораторной практике применяется «сэндвич-технология». При этом подходе применяются 2 зонда, гомологичные различным участкам нуклеотидной цепи ДНКили РНК-мишени. Один зонд фиксируют на мембране для того, чтобы связать искомую мишень, присутствующую в исследуемом образце. После осуществления гибридизации мембрану отмывают от исследуемого материала и добавляют раствор, содержащий второй зонд, который представляет собой коньюгат олигонуклеотида и какой-либо метки. Процесс гибридизации проводят повторно, при этом зонд с меткой взаимодействует с искомым участком ДНК (РНК). Детекция проводится в зависимости от природы метки ферментно-гибридизационным,

радиографическим, авторадиографическим, флюоресцентным или хемилюминесцентным методами. Преимущество этого подхода заключается в том, что практически сведены к минимуму подготовка клинического материала и очистка нуклеиновых кислот. В современных наборах реагентов,

предлагаемых для диагностических исследований, применяется хемилюминесценция, которая обеспечивает чувствительную детекцию результатов гибридизации. Технология автоматизирована, время выполнения анализа составляет 2,5-3 ч.

По мере миниатюризации соответствующих носителей-подложек для гибридизации в практику вошли микрочипы (microarrays) с сотнями и тысячами ДНК-зондов для выявления практически любых известных генов,

их вариантов и мутаций. Часто для гибридизации применяют не исходные нуклеиновые кислоты, а продукты амплификации целевых генов. Учет результатов гибридизации на биочипах осуществляется посредством оптических устройств, предлагаемых кампанией-разработчиком.

Метод полимеразной цепной реакции. Полимеразная цепная реакция

(ПЦР) – молекулярно-биологический метод исследования, получивший широкое распространение в современных лабораториях и используемый для диагностики инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний,

а также для исследования состава условнопатогенной флоры. Ценность

140