Учебник

автоматических скарификаторов, гарантирующих низкую травматичность и соблюдение нужной глубины прокола, в зависимости от типа скарификатора.

Во многих лабораториях при взятии гематологических проб капиллярной крови считается допустимым нарушать соотношение крови и ЭДТА, что приводит к искажению количества тромбоцитов при подсчете в автоматических анализаторах.

При взятии капиллярной крови возможен ряд особенностей, которые бывает трудно стандартизировать: физиологические – холодные,

цианотичные пальцы, методические – малый объём исследуемой крови и в связи с этим необходимость разведения образца для анализа.

Непосредственно перед исследованием кровь необходимо тщательно перемешать в течение нескольких минут для разведения антикоагулянта и равномерного распределения форменных элементов в плазме. Длительное постоянное перемешивание образцов до момента их исследований не рекомендовано из-за возможного травмирования и распада патологических клеток. Мазки крови рекомендовано делать не позднее 1-2 ч после взятия крови.

Венозную кровь считают лучшим материалом для клинического исследования крови. Кровь берется из кубитальной вены, жгут накладывается не более 1 мин, кулак разжимается после попадания первых капель крови в пробирку. При более длительном наложении жгута получают завышенные результаты общего белка, альбуминов (+6-12%), более 3 мин – аланинаминотрансферазы (+10%), билирубина (+8%). При наложенном жгуте и сжатом кулаке значительно повышается уровень калия в плазме (+15-25%).

Кровь должна поступать свободным током непосредственно в пробирку, содержащую антикоагулянт. Следует избегать использования шприца с иглой из-за его недостаточной безопасности для медперсонала и невозможности исключения гемолиза крови при переносе ее под давлением в пробирку. Взятие крови шприцем без антикоагулянта с последующим переливанием в пробирку недопустимо из-за формирования микросгустков и

71

гемолиза. Кроме того, в момент переливания крови в пробирку она подвергается воздействию окружающей среды, что приводит к потере стерильности и снижению качества образца. Данный способ взятия проб венозной крови не может быть стандартизован и не обеспечивает безопасность пациента и медперсонала.

Рекомендуемыми иглами для взятия венозной крови в целях оценки состояния гемостаза являются иглы с маркировкой диаметра просвета (G)

22-19 (чем больше номер, тем меньше диаметр: 0,6-1,0 мм). У детей можно применять размер 23. Очень узкие иглы (более 25 G) применять нельзя, так как при кровотоке через иглу с таким диаметром образуется сгусток и активируется система гемостаза. Иглы с очень широким просветом (менее 16 G) могут вызвать гемолиз отбираемой крови вследствие турбулентности кровотока в канале иглы. После инфузии (трансфузии) наикратчайший срок,

после которого можно брать кровь составляет 1 час. При необходимости проведения инфузии следует взять кровь из другой руки. При взятии крови из в/в катетера необходимо промыть его физиологическим раствором, затем первые 3-5 мл крови сбросить в специальные пробирки.

Взятие крови вакуумными системами имеет ряд преимуществ,

основными из которых являются обеспечение высокого качества пробы и предотвращение любого контакта с кровью. Вакуумные системы состоят из трех основных элементов, соединяющихся между собой в процессе взятия крови: стерильной одноразовой пробирки с крышкой и дозированным содержанием вакуума; стерильной одноразовой двусторонней иглы или иглы-бабочки, закрытой с обеих сторон защитными колпачками; одноили многоразового иглодержателя. Под действием вакуума кровь втягивается через иглу и безопасный клапан напрямую из вены в пробирку и сразу же смешивается с химическим реактивом, находящимся как в виде жидкого содержимого, так и нанесенного на внутренние стенки пробирок. В практике широко используются иглы-бабочки вместо обычных игл и держатели,

72

которые необходимо использовать при взятии крови во флаконы для

микробиологических исследований.

гематологических анализаторах. Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА-

К2ЭДТА или К3ЭДТА) – предпочтительный антикоагулянт при подсчёте форменных элементов крови с использованием автоматических гематологических анализаторов. Использование Na2ЭДТА не рекомендовано вследствие его плохой растворимости. Концентрация ЭДТА во взятой крови должна быть постоянной и составлять 1,5-2,2 мг/мл крови.

Применение в качестве антикоагулянтов гепарина или цитрата натрия сопровождается структурными изменениями клеток, поэтому эти антикоагулянты не рекомендованы для использования как при автоматизированном, так и морфологическом исследовании крови.

Необходимо строго следить за количеством взятой крови, объём которой должен соответствовать указанной отметке на пробирке.

Несоблюдение этого условия, а также недостаточно тщательное перемешивание крови приводит к изменению конечной концентрации антикоагулянта, что может повлечь за собой появление микросгустков,

неточное определение концентрации клеточных элементов, искажение морфологической структуры клеток. Для обеспечения в пробе точного соотношения кровь/антикоагулянт масса наполнителя в пробирках должна строго соответствовать заданному объему крови. Пробирки должны заполняться полностью, в пределах ±10% от указанного объема (т.е.

пробирка на 4,5 мл должна заполняться в объеме между 4 и 5 мл).

Неправильное соотношение кровь/реагент в пробе ведет к ошибочным результатам анализа. Сразу после заполнения и извлечения пробирки из держателя ее нужно аккуратно перевернуть несколько раз (количество раз определяется типом наполнителя) на 180° для смешивания пробы с наполнителем. Перемешивание пробирок должно соответствовать определенной кратности и производиться медленными вращательными

73

движениями сразу после заполнения их кровью и извлечения из держателя.

Пробирки должны быть поставлены вертикально в штатив и доставлены в таком виде в лабораторию. В плохо перемешанной пробе образуются микросгустки, ведущие к искажению результатов тестов, а также к поломкам лабораторных анализаторов вследствие закупорки пробозабирающих зондов.

Пробу нельзя трясти, ее надо плавно перемешать. При слишком энергичном перемешивании возможны пенообразование и гемолиз, что может негативно сказаться на результатах лабораторных исследований.

При выполнении гематологических исследований на значительном удалении от места взятия крови неизбежно возникают проблемы, связанные с условиями транспортировки. При перевозках пробирок с кровью рекомендовано использовать герметично закрытые пластиковые пробирки и специальные транспортные изотермические контейнеры.

Получение сыворотки и плазмы крови. Основные закономерности при взятии крови для получения сыворотки и плазмы.

Сыворотка. При получении сыворотки основная тенденция – ускорить свертывание крови без повреждения клеток. Для этого кровь пускают по стенке прибирки, чтобы контакт со стенкой уже активировал свертывание. В

коммерческих пробирках внутрь помещают полистероловые гранулы для усиления контактной активации свертывания.

В лабораторию может отдаваться как цельная кровь, так и отобранная сыворотка. Венозная кровь после взятия отстаивается в пробирке при комнатной температуре (18-25°С) в течение 30-60 минут (до полного образования сгустка). Пробирки для исследования сыворотки следует центрифугировать не ранее чем через 30 минут после взятия крови, чтобы гарантировать свертывание крови. Сыворотка должна быть отделена от кровяного сгустка не позднее двух часов после взятия крови. Для отделения сыворотки от форменных элементов необходимо: центрифугировать кровь после образования сгустка при 1300g в течение 10 минут; в пробирках с гелем – центрифугировать кровь при 1500-2000g в течение 10 минут, а затем

74

отобрать сыворотку в одноразовую пластиковую пробирку. Гель обеспечивает стабильный барьер между сывороткой и форменными элементами на 48 часов. Повторное центрифугирование пробирок с гелем не разрешается.

Полученная сыворотка до передачи курьеру должна храниться в холодильнике (от +2°С до +4°С) или в контейнере с хладогеном. Отобранную сыворотку можно хранить в холодильнике в течение 1-2 дней. Для более длительного хранения (что не желательно), сыворотку необходимо заморозить. После размораживания сыворотку необходимо тщательно перемешать. Повторное замораживание недопустимо.

Плазма крови. При взятии крови в пробирку следует обеспечить первичное взаимодействие крови с антикоаулянтом, избегая контактного активирования системы свертывания.

На коагулологические исследования взятие крови осуществляется только из вены. Кровь пациента для определения протромбинового времени и других тестов на его основе до передачи курьеру должна храниться при комнатной температуре (от +20°С до +24°С), центрифугировать не позднее,

чем через 45 минут после взятия, само исследование должно быть проведено в течение 2-х часов с момента взятия крови. Хранение в холодильнике или в контейнере с хладогеном категорически запрещено. Для проведения всех прочих тестов плазму следует хранить при температуре от +2°С до +8°С не более 4 часов. Допускается однократное замораживание бедной тромбоцитами плазмы при температуре от – 20°С до – 40°С на срок до нескольких недель без значительной потери активности факторов свертывания. Размораживание плазмы следует осуществлять при температуре +37°С, повторная заморозка недопустима. Кровь отправляется в лабораторию в день взятия. До следующего дня хранить кровь нельзя!

Транспортировка крови на большие расстояния и ее частое встряхивание искажает результаты анализов.

75

На иммунологический анализы (витамины, гормоны, иммунный статус, электролиты) используются пробирки с лития гепарином (в т.ч. для исследования ионов кальция и магния) или натрия гепарином. При комнатной температуре плазму необходимо использовать для анализа в период от 2 до 6 часов после взятия образца. Плазма отделяется центрифугированием (1000-1500g, 15 минут). Если доставка в лабораторию осуществляется в течение дня, то она хранится при температуре от +4°С до

+8°С в холодильнике и доставляется в лабораторию в специальных транспортных контейнерах с хладогеном, время доставки плазмы в лабораторию не должно превышать 24 часа. Для более длительного хранения плазма может быть заморожена при температуре – 20°С, при этом она может храниться до 4 недель. При быстром замораживании до – 70°С срок хранения может быть продлен до 6 месяцев.

На глюкозу применяются пробирки с фторидом натрия + оксалат калия или фторидом натрия + К2ЭДТА в том случае, если кровь хранится более

2 часов. Считается, что эритроциты, даже в осадке отцентрифугированной крови, способны потреблять за 1 час до 10% глюкозы плазмы. Натрия фторид ингибирует процесс распада глюкозы в образце до 6 часов при комнатной температуре. Следует принимать во внимание, что содержание глюкозы в цельной крови на 10% ниже, чем в плазме. Допускается хранение пробы до

24 часов в холодильнике при температуре от +4°С до +8°С в вертикальном положении.

Взятие крови для приготовления толстой капли. Исследование толстой капли крови, окрашенной по Романовскому-Гимзе, является основным методом диагностики малярии и других кровепаразитов

(микрофилярии, бабезии)

При изготовлении толстых капель палец поворачивают проколом вниз.

К выступающим каплям крови прикасаются предметным стеклом, на которое берут 2-3 капли крови и затем иглой или углом другого предметного стекла кровь размазывают, чтобы получить на стекле овал диаметром около 1 см

76

или полосу длиной 2-3 см. Слой крови не должен быть слишком толстым, так как в последнем случае при высыхании он превращается в корочку и легко отстает от стекла. После изготовления толстых капель их высушивают,

положив стекла на горизонтальную поверхность. Для ускорения высыхания стекол их можно помещать в термостат (30-35оС). Нужно предохранять стекла от запыления.

Взятие крови из вены для обнаружения LE-клеток. LE-клетки или клетки красной волчанки (LE-феномен) – это нейтрофилы или моноциты,

содержащие крупные гомогенные базофильные включения, представляющие собой фагоцитированные ядра погибших лейкоцитов, а собственное ядро клетки оттеснено. Формирование LE-клеток красной волчанки происходит при наличии LE-фактора в крови и других биологических жидкостях. LE-

фактор – это фракция аутоантител к ядрам клеток (анти-ДНК антитела). Эти антитела разрушают хроматин ядра, он превращается в аморфную массу, из которой образуются гематоксилиновые тела, или волчаночные тельца.

LE-клетки могут быть обнаружены в крови при системной красной волчанке и некоторых других аутоиммунных заболеваниях (системной склеродермии, дерматомиозите).

LE-клеток крови исследуют в прпаратах лейкоконцентрата. Есть несколько модификаций получения лейкоконцентрата.

Методика Цинкхама-Конли в модификации Е. Н. Новоселовой.

Принцип. Механическое воздействие на кровь, облегчающее образование LE-феномена.

Реактивы. 1) натрия оксалат; 2) краска Романовского-Гимзы или азур-

эозин; 3) метиловый спирт для фиксации мазков.

В пробирку с 10 мг оксалата натрия вносят 10 мл венозной крови,

тщательно перемешивают и оставляют стоять на 1,0-1,5 ч при комнатной температуре. Вносят в пробирку 8-10 стеклянных бусинок диаметром 3-4 мм,

плотно закрывают пробкой и перемешивают, переворачивая пробирку пробкой то вверх, то вниз в течение 30 мин. Затем отстаивают в течение 1 ч

77

при комнатной температуре для разделения слоев. Плазму отсасывают пастеровской пипеткой и вносят в центрифужную пробирку.

Центрифугируют при 1000 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а из осадка готовят мазки. Высохшие мазки фиксируют в метиловом спирте и окрашивают гематологическим красителем.

Методика Харгревеса-Циммера. Реактивы: 1) метиловый спирт; 2)

краска Романовского-Гимзы или азур-эозин.

В пробирку набирают 10 мл венозной крови и оставляют при комнатной температуре (можно в термостате при 37°С) на 2 ч.

Свернувшуюся кровь выливают на металлическое сито, поставленное на чашку Петри, и фарфоровым пестиком протирают сгусток. Содержимое чашки Петри переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при

2000 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а из верхнего слоя осадка готовят мазки. Высохшие мазки фиксируют метанолом и окрашивают по принятым в гематологии методикам.

Микрометод. бВ мерную центрифужную пробирку отмеривают 1 мл

3% раствора трилона В и 4 мл крови, взятой из вены самотеком. Осторожно смешивают и ставят в термостат под углом 45° при температуре 37° на 15-20

мин. Как только отделится 2-3 мл плазмы, верхний слой ее осторожно отсасывают пастеровской пипеткой и выливают. Нижний слой плазмы и лейкоцитарную пленку отбирают в центрифужную пробирку.

Центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин. Из осадка готовят мазки, красят, как обычные мазки периферической крови. Кровь можно брать не натощак.

2.3. Получение материала для цитологического исследования

Получение спинномозговой жидкости. Ликвор чаще получают люмбальной, реже субокципитальной пункцией.

Люмбальная пункция проводится между III и IV поясничными позвонками по линии Quincke (линия, соединяющая самые высокие части

78

гребней двух подвздошных костей). Пункцию можно также проводить между

L4-L5; L5-S1 и между L2 -L3.

Субокципитальная (цистернальная) пункция проводится между основанием черепа и 1-м шейным позвонком на высоте линии, соединяющей сосцевидные отростки.

При проведении люмбальной пункции необходимо:

первые 3-5 капель ликвора удалить, что позволяет освободиться от примеси «путевой» крови, попадающей в первую порцию ликвора в результате повреждения иглой кровеносных сосудов, расположенных в области эпидурального пространства;

собрать 3 порции (в исключительных случаях две) в стерильные пробирки, плотно закрыть, на каждой пробирке указать ее порядковый номер, имя, отчество и фамилию больного, время пункции, диагноз и перечень необходимых исследований;

собранный в пробирки ликвор доставляется в клинико-

диагностическую лабораторию немедленно;

в лаборатории отмечается время доставки ликвора.

С помощью люмбальной пункции у взрослого человека можно без осложнений получить 8-10 мл ликвора, у детей, включая детей младшего возраста, 5-7 мл, у грудных детей – 2-3 мл.

Получение материала для цитологического исследования

выпотных жидкостей. Эвакуация выпота проводится пункцией серозной полости. Пунктат высвобождают в чистую сухую, а при необходимости – в

стерильную посуду. Пункцию должен проводить лечащий врач или процедурная медицинская сестра. В лабораторию следует доставить максимальное количество жидкости. Для исследования рекомендуется разделить пробу: 10 мл нативной жидкости будет использовано для биохимических и серологических исследований. К остальной жидкости рекомендуется добавить антикоагулянты или стабилизаторы:

ЭДТА – для подсчёта клеточного состава жидкости;

79

гепарин для цитологического исследования и для измерения рН;

фторид натрия для определения лактата;

цитрат натрия – часто рекомендуется использовать 5% раствор цитрата натрия. Если же есть возможность исследовать жидкость сразу после её эвакуации, то добавления цитрата натрия лучше избегать. Раствор может влиять на морфологию клеток, вызывая их деструкцию, а также изменять реакцию среды, что, в свою очередь, может привести к плохому прокрашиванию препаратов. К тому же жидкость далеко не всегда подвергается свертыванию.

Если проводится биохимическое исследование, то одновременно следует отобрать 5 мл венозной крови для определения градиента

«сыворотка/выпотная жидкость» для альбумина, a-амилазы, билирубина,

холестерина, общего белка, ЛДГ и триглицеридов.

Исследование клеточного состава свернувшейся жидкости недопустимо, поскольку клетки при свёртывании поглощаются сгустком и в осадок центрифугата не выпадают или обнаруживаются в незначительном количестве.

Получение материалов для паразитологического исследования.

Фекалии, полученные после самостоятельной дефекации, доставляются в лабораторию свежими (не более суточной давности) в количестве 10-50 г (объем чайной/столовой ложки).

Посуда, в которой кал транспортируется и хранится, должна быть одноразовой, изготовлена из прозрачного или полупрозрачного неокрашенного материала (из стекла или пластика), с плотно закрывающейся крышкой, не содержать остатков моющих средств. На наклеенной этикетке обязательно, помимо данных пациента, указывается дата и время сбора пробы. Материал, доставленный в лабораторию, исследуются в этот же день.

При подозрении на стронгилоидоз, анкилостомидозы, трихостронгилоидозы материал необходимо исследовать сразу после получения его от больного не

позднее 1 часа.

80