книги / Основы биотехнологии

Для каждой колбы рассчитывают сульфитные числа после первого и второго периодов аэрации и берут среднее из двух чисел. Полученные результаты записывают в таблицу.

Зависимость скорости поступлений кислорода в раствор сульфита от интенсивности аэрации

Контрольные вопросы

1.Что характеризует сульфитное число?

2.Достоинства и недостатки сульфитного метода оценки массообмена.

3.Приведите уравнение скорости массопередачи по кислороду

впроцессе биосинтеза.

4.Что входит в понятие «объемный коэффициент массопере-

дачи»?

5.Какие выводы можно сделать по лабораторной работе?

6.Какие факторы оказывают влияние на массообмен по кислороду в ферментере и какими приемами его можно повысить?

11

ТЕМА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТА И БЕЛКА В КОРМОВЫХ ДРОЖЖАХ

Растущие потребности животноводства в сбалансированных по белку кормовых рационах не могут быть удовлетворены за счет традиционных ресурсов, поэтому существенную значимость приобретает изыскание альтернативных источников, в частности, получение и применение для этих целей биомассы микроорганизмов. Преимущества белка, полученного с помощью низших организмов, велики. Эту биомассу можно производить круглогодично на дешевом сырье, в ней содержится большое количество белка (40–85 %). Для сравнения приведем данные по содержанию белка в продуктах животноводства (%): го-

вядина – 16,5; свинина– 10,2; птица– 18,6; яйца– 12,9; молоко – 3,5.

По содержанию большинства незаменимых аминокислот (лизин, треонин, триптофан и др.) белок многих дрожжей и бактерий соответствует эталону – белку женского молока, яиц, а количество серосодержащих аминокислот (метионина и цистеина) в белке одноклеточных ниже. Состав биомассы микроорганизмов легко поддается технологическому и селекционному контролю, и можно подобрать или создать методами генетической инженерии микроорганизмы, имеющие избыток именно тех аминокислот, которые дефицитны в потребляемых растительных кормах, и таким образом сбалансировать их.

Использование микробного белка позволяет при одном и том же количестве кормового зерна получить в 1,5–2 раза больше продукции животноводства. Затраты на производство такого белка примерно такие же, как на производство растительного белка, в то время как по биологической ценности и составу кормовые препараты из одноклеточных более полноценны.

Азот входит в состав белков, нуклеопротеидов, фосфопротеидов и других соединений, играющих важную роль в жизни живых организмов и растений. По содержанию азота (протеина) в кормах оценивается их питательность. Под общим азотом понимают сумму белкового и небелкового азота.

12

Основным методом определения азота в органических соединениях является метод Кьельдаля. Этот метод отличается от других аналитических методов наибольшей точностью и зачастую применяется в качестве эталона при разработке новых методов определения азотсодержащих веществ. Недостаток метода – длительность выполнения анализа. В связи с этим разработано много других менее трудоемких методов, основанных на способности азота и самих белков давать окрашенные продукты реакции со многими соединениями. Однако по точности колориметрические методы уступают методу Кьельдаля.

Метод основан на определении количества общего азота, содержащегося в навеске продукта, при озолении органических веществ концентрированной серной кислотой в присутствии катализаторов (сернокислой меди, перекиси водорода, металлического селена, окиси селена, молибдата натрия и др.).

При нагревании кислота разлагается на диоксид серы, воду и активный кислород, который окисляет углерод и водород органических соединений до СО2 и воды, а содержащийся в органических соединениях азот отщепляется в виде аммиака:

R-CH-NH2COOH + H2SO4 → SO2 + CO2 + H2O + NH3.

Газы и вода улетучиваются, а аммиак связывается серной кислотой и остается в растворе: 2NH3+ H2SO4= (NH4)2 SO4.

Образовавшийся сернокислый аммоний при нагревании разлагается щелочью с выделением аммиака:

(NH4)2SO4 + 2NaOH = 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O

и определяется при отгонке в раствор кислоты (серной или борной) известной концентрации. Избыток последней оттитровывают 0,1 н раствором щелочи по разности между взятым объемом кислоты и объемом щелочи, пошедшей на титрование, вычисляют количество кислоты, связавшее аммиак: 1 мл точно 0,1 н раствора серной кислоты связывает аммиак в количестве, соответствующем 1,4 мг или

0,0014 г азота.

13

Лабораторная работа 3 Определение содержания общего азота (сырого протеина)

Содержание общего азота, сырого протеина (общего белка) в кормовых продуктах, в том числе и дрожжах, определяют по методу Кьельдаля или по одной из многих его модификаций.

3.1. Определение влажности

Оборудование:

1)сушильный шкаф электрический с терморегулятором;

2)весы аналитические;

3)эксикатор с поглотителем влаги;

4)бюксы стеклянные или металлические.

Сущность метода заключается в высушивании продукта до постоянной массы при установленных температуре и времени. Массовая доля влаги есть отношение потери массы продукта после высушивания к массе исходной навески.

Предварительно перед применением бюксы тщательно моют, сушат в сушильном шкафу не менее 40 мин и помещают в эксикатор. Пробу дрожжей массой около 5 г растирают в фарфоровой ступке.

Затем высушенную и охлажденную бюксу вместе с крышкой взвешивают на аналитических весах, записывая показания с точностью до 4-го десятичного знака. Помещают в нее навеску продукта массой около 2 г, закрывают крышкой и снова взвешивают. Бюксу с навеской помещают в сушильный шкаф, предварительно нагретый до 130 ± 5 оС (крышка снимается и помещается рядом с бюксой). По истечении 40 мин высушивания с помощью тигельных щипцов закрывают бюксу, вынимают ее из шкафа и ставят в эксикатор для охлаждения до комнатной температуры. После охлаждения закрытую бюксу с навеской взвешивают.

Содержание влаги W в процентах вычисляют по формуле

W m m1 100 %, m

где m – масса навески дрожжей (с вычетом массы пустой бюксы) до высушивания, г; m1 – масса навески дрожжей (с вычетом массы пустой бюксы) после высушивания, г.

14

3.2. Проведение испытания

Оборудование, материалы и реактивы:

1)весы аналитические;

2)ступка фарфоровая;

3)колба Кьельдаля на 1 л;

4)пробирки стеклянные (большие);

5)воронки стеклянные диаметром 4–5 см;

6)бюретка на 50 мл;

7)колбонагреватель или электроплитка;

8)цилиндры мерные;

9)холодильник стеклянный;

10)воронки капельные;

11)пипетка на 10 мл, пипетка Мора на 50 мл;

12)каплеуловитель;

13)промывалка лабораторная;

14)бумага лакмусовая;

15)кислота серная концентрированная;

16)кислота серная 0,1 н раствор;

17)гидроокись натрия 33 % раствор;

18)гидроокись натрия 0,1 н раствор;

19)перекись водорода 30 % раствор;

20)индикатор смешанный.

Ход анализа

Взвешивают около 0,5 г растертых в ступке дрожжей с погрешностью не более 0,0002 г в длинной сухой пробирке, свободно входящей в горлышко колбы Кьельдаля. В сухую колбу Кьельдаля осторожно высыпают навеску дрожжей, по возможности глубже опуская пробирку в горлышко колбы. Пробирку вновь взвешивают. По разнице между первым и вторым взвешиваниями определяют массу навески, взятой для анализа. В колбу с навеской вливают цилиндром около 15 мл концентрированной серной кислоты, смывая прилипшие к горлышку колбы частицы дрожжей. Колбу с содержимым ставят

внаклонном положении в колбонагреватель, закрепив горло колбы

вштативе.

15

Сжигание продукта производят под тягой, так как при сжигании происходит выделение сернистого ангидрида. Для уменьшения испарения жидкости горло колбы закрывают воронкой. При сжигании необходимо следить, чтобы содержимое колбы сильно не вспенивалось. Сжигание дрожжей с кислотой проводят в течение 40 мин. По истечении этого времени, отключив нагрев, в колбу Кьельдаля пипеткой осторожно по каплям по стенке колбы приливают 10 мл перекиси водорода, по мере уменьшения выделения белых паров скорость приливания увеличивают. Перекись водорода приливают до полного обесцвечивания раствора или приобретения им синевато-зеленоватого оттенка. Общий расход перекиси составляет 10–20 мл. После окончания приливания перекиси водорода сжигание продолжают еще 20 мин. Общее время сжигания продолжается около 1 ч 10 мин.

По окончании сжигания колбу охлаждают и, добавив дистиллированную воду, доводят общий объем раствора до 200–250 мл.

Образовавшуюся соль сернокислого аммония разрушают гидратом окиси натрия, и отгонку аммиака производят в специальном приборе. Для этого колбу Кьельдаля соединяют через каплеуловитель с холодильником. Нижний конец трубки холодильника, удлиненный до 16–17 см, погружают в 0,1 н раствор серной кислоты, точно отмеренный пипеткой Мора в приемную коническую колбу вместимостью 250 мл в количестве 50 мл. В раствор серной кислоты добавляют 5–6 капель смешанного индикатора. После окончания подготовки установки для проведения анализа включают нагрев и осторожно приливают из капельной воронки 100 мл 33 % раствора гидроокиси натрия. Капельную воронку промывают два-три раза 10– 15 мл дистиллированной воды, оставляя небольшое количество жидкости (до 5 мл) в воронке для создания гидрозатвора.

В процессе отгонки аммиака следят за тем, чтобы конец трубки холодильника был погружен в раствор, находящийся в приемной колбе, на глубине не более 1 см.

Отгонку ведут до тех пор, пока объем раствора в приемной колбе не увеличится примерно в три раза. Окончание отгонки аммиака проверяют по лакмусовой бумаге, смачивая ее жидкостью, стекаю-

16

щей из трубки холодильника. Если лакмусовая бумага не изменяет окраску, отгонку аммиака считают законченной, если посинеет – отгонку следует продолжать.

По окончании отгонки аммиака приемную коническую колбу опускают с таким расчетом, чтобы конец трубки холодильника не касался раствора. Колбу Кьельдаля отсоединяют от холодильника, а затем из промывалки промывают дистиллированной водой внутреннюю поверхность трубки холодильника и наружную часть трубки, которая опускалась в кислоту. Содержимое приемной колбы титруют 0,1 н раствором гидроокиси натрия до обесцвечивания (одна капля избытка гидроокиси натриядаетзеленоеокрашиваниераствора).

Контрольный опыт в аналогичных условиях, но без навески дрожжей, проводят при использовании заново приготовленных реактивов.

Обработка результатов

Содержание общего азота (Х) в пересчете на абсолютно сухое вещество в процентах вычисляют по формуле

где V1 – объем 0,1 н раствора гидроокиси натрия, израсходованный на титрование 50 мл 0,1 н раствора серной кислоты в контрольном (холостом) опыте, мл; V2 – объем 0,1 н раствора гидроокиси натрия, израсходованный на титрование остатка серной кислоты, не связанной с выделившимся аммиаком при его отгонке, мл; К – поправочный коэффициент к титру 0,1 н раствора гидроокиси натрия; 0,0014 – количество азота, эквивалентное 1 мл точно 0,05 моль/л (0,1 н) раствора серной кислоты; m – масса навески дрожжей, г; W – влажность дрожжей, %.

Для пересчета на протеин количество определенного азота умножают на 6,25, условно принимая, что в белках в среднем содер-

жится 16 % азота (100/16 = 6,25).

17

Лабораторная работа 4 Определение массовой доли белка по Барнштейну

Метод определения истинного белка по Барнштейну основан на отделении белковой фракции от других азотсодержащих веществ путем осаждения ее сульфатом меди в щелочной среде. При таком разделении веществ в осадке остается белковая фракция биомассы микроорганизмов, количество которой определяется методом Кьельдаля.

Оборудование, материалы и реактивы:

1)весы аналитические;

2)ступка фарфоровая;

3)стаканчик для взвешивания;

4)фильтр обеззоленный бумажный;

5)термостат;

6)стакан на 100 мл – 3 шт.;

7)колба Кьельдаля на 1 л;

8)воронка стеклянная;

9)цилиндр мерный на 100 мл;

10)электроплитка;

11)медь сернокислая 5-водная, 6 % раствор;

12)натрия гидроксид, 1,25 % раствор;

13)кислота серная концентрированная;

14)кислота серная 0,1 н раствор;

15)перекись водорода, 30 % раствор.

Проведение испытания

Навеску дрожжей определенной влажности массой 0,5–0,8 г взвешивают на аналитических весах с погрешностью не более 0,0002 г

влабораторном стакане вместимостью 100 мл.

Встакан при перемешивании вносят 30–50 мл нагретой до кипения дистиллированной воды, после чего прибавляют 25 мл 6 % раствора 5-водной сернокислой меди и затем при помешивании приливают 25 мл 1,25 % раствора гидроокиси натрия.

После отстаивания осадка жидкость сливают через фильтр. Осадок промывают горячей водой и количественно переносят на этот же

18

фильтр. Промывку горячей водой осадка на фильтре ведут до тех пор, пока фильтрат, стекающий с воронки, не будет бесцветным. Осадок с фильтром подсушиваютвтермостатепри105оСоколо20 мин.

Затем осадок вместе с фильтром помещают в колбу Кьельдаля, добавляют около 20 мл концентрированной серной кислоты.

Сжигание пробы, отгонку аммиака и обработку результатов проводят как при определении содержания сырого протеина по методу Кьельдаля.

Контрольные вопросы

1.Какова структурная формула белка?

2.Какие азотсодержащие вещества присутствуют в составе биомассы микроорганизмов?

3.Что такоенезаменимыеаминокислоты? Приведитепримеры.

4.Объясните, в чем разница значений определения протеина по методу Кьельдаля и Барнштейна?

5.Каков коэффициент пересчета азота в белок?

6.Возможно ли определение белка в сырой биомассе?

7.Какую предобработку необходимо провести при определении азота в жидком продукте методом Кьельдаля?

19

ТЕМА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ ИЗ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

Лабораторная работа 5 Определение липидов в кормовых дрожжах

Цель работы: ознакомление с технологией экстракционного извлечения липидов из биомассы микроорганизмов, закрепление навыков проведения экстракции, определение полноты выделения липидов из биомассы и их содержания в готовом продукте.

Липиды – большая группа природных веществ, разнообразных по химической структуре и физико-химическим свойствам. Имеется несколько трактовок понятия липиды и различных схем их классификации.

Под липидами в производстве микробного белка подразумеваются все растворимые в неполярных растворителях компоненты клеток микроорганизмов.

Липиды в клетках микроорганизмов выполняют многие чрезвычайно важные функции. Они входят в состав клеточной мембраны, митохондрий, клеточной стенки, хлоропластов и других органелл. Липопротеиновые комплексы играют важную роль в процессах метаболизма. С ними в значительной мере связаны активный перенос различных веществ через мембраны и распределение этих веществ внутри клетки. С составом липидов во многом связаны такие свойства организмов, как термолерантность и термофильность, психрофильность, кислотоустойчивость, вирулентность и другие признаки. Кроме того, липиды могут выполнять функции запасных веществ.

Общее количество липидов у микроорганизмов обычно колеблется от 0,2 до 40 % от абсолютно сухих веществ клетки. К числу микроорганизмов, богатых липидами, т.е. содержащих более 10 % от сухой биомассы клетки, принадлежат дрожжи, микобактерии и коринебактерии. В условиях метаболизма, благоприятных для накопления этих продуктов, содержание липидов может достигать 60–70 % от сухих веществ клетки.

20