книги / Основы биотехнологии

Для направленного биосинтеза липидов используются среды, бедные азотом, но богатые углеводами. Установлено, что для углеводного сырья соотношениеN : С= 1 : 40, а дляуглеводородного 1: 30.

Условия культивирования (рН, температура, аэрация) также оказывают существенное влияние на количество и фракционный состав синтезируемых липидов. В процессе культивирования микроорганизмов на различных субстратахможнополучитьвсе классы липидов:

простые липиды (нейтральные жиры, воски);

сложные липиды (фосфолипиды, гликолипиды);

производные липидов (жирные кислоты, спирты, углеводороды, витамины Е, К).

Липиды микроорганизмов после их выделения и соответствующей обработки могут быть использованы в различных отраслях промышленности, высвобождая для пищевых целей значительное количество жиров растительного и животного происхождения.

В промышленных условиях микробные липиды выделяют из сухой биомассы дрожжей, полученной при их культивировании на гидролизатах растительного сырья, торфа или углеводородах нефти, методом экстракции.

Экстракционное отделение включает в себя оборудование как для самого процесса экстракции, так и для стадий регенерации растворителя.

Впроцессе экстракции параллельно получают два ценных продукта – обезжиреннуюмикробнуюбиомассу(биошрот) илипиды(биожир).

Оборудование, материалы и реактивы:

1) колба коническая на 250 мл – 2 шт.; 2) цилиндр мерный – 1 шт.; 3) колба круглодонная на 250 мл – 2 шт.; 4) делительная воронка – 2 шт.; 5) эксикатор; 6) обратный холодильник; 7) водяная баня;

8) фильтры бумажные;

9) роторный вакуумный испаритель;

10)сушильный шкаф;

11)весы аналитические;

21

12)петролейный эфир;

13)пропанол;

14)соляная кислота, разбавленная водой в соотношении 2:1;

15)диэтиловый эфир.

Проведение испытания

В сухую коническую (качалочную) колбу помещают около 2 г кормовых дрожжей, предварительно взвешенных с точностью до 0,01 г. Затем добавляют 100 мл предварительно подготовленной экстракционной смеси, состоящей из 75 % петролейного эфира, 20 % пропанола, 5 % дистиллированной воды. Колбу закрывают ватным тампоном или пробкой, подписывают, ставят на качалку и проводят экстракцию липидов в течение 1,5–2 ч при температуре 35–40 °С.

По окончании процесса экстракции колбу снимают с качалки, содержимое колбы фильтруют в предварительно взвешенную с точностью до 0,01 г чистую круглодонную колбу емкостью 250 мл через складчатый фильтр. Остатки биомассы из качалочной колбы смывают на предварительно взвешенный фильтр 30 мл свежей экстракционной смеси.

Выделение липидов из раствора (мисцеллы) проводят с помощью отгонки растворителя на роторно-пленочном испарителе под вакуумом, создаваемым водоструйным насосом.

После отгонки растворителей круглодонную колбу с биожиром отсоединяют от прибора и помещают в сушильный шкаф, предварительно нагретый до 105 °С, выдерживают при этой температуре 30– 40 мин для полного удаления растворителей. Затем колбу охлаждают в эксикаторе, взвешивают на аналитических весах с точностью до 0,01 г и определяют количество проэкстрагированных липидов.

Оставшийся после экстракции и фильтрования биошрот вместе с фильтром помещают в чашку Петри, сушат в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1,5–2 ч, затем охлаждают в эксикаторе, взвешивают биошрот с точностью до 0,01 г и составляют материальный баланс процесса экстракции.

Параллельно определяют содержание липидов в биомассе с применением кислотного гидролиза. Для этого в круглодонную колбу емкостью 250 мл помещают около 2 г кормовых дрожжей, предвари-

22

тельно взвешенных с точностью до 0,01 г, из той же партии, которая использовалась для экстракции. В колбу добавляют 2–3 мл пропанола, 10 мл разбавленной соляной кислоты (HCl : H2O = 2 : 1), а затем содержимое колбы тщательно перемешивают.

Колбу соединяют с обратным холодильником, нагревают реакционную смесь на водяной бане при 75 °С в течение 1 ч. Затем в колбу через обратный холодильник добавляют 10 мл пропанола, колбу снимают с бани и оставляют для охлаждения. После охлаждения содержимое колбы переливают в делительную воронку, смывая остатки гидролизата со стенок колбы 20 мл диэтилового эфира. Смесь

вворонке энергично встряхивают в течение 1 мин, добавляют 20 мл петролейного эфира и снова встряхивают в течение 1 мин.

После расслаивания отделяют кислотный слой, сливая его обратно

вкруглодонную колбу, а эфирный слой переливают в чистую делительную воронку. Экстракцию кислотного слоя проводят еще дважды, используякаждыйраз15 млдиэтиловогои 15 млпетролейногоэфира.

По окончании экстракции реакционную смесь (кислотный слой) сливают в канализацию, а объединенный эфирный экстракт дважды промывают в делительной воронке дистиллятом порциями по 20 мл, каждый раз встряхивая смесь 30–40 с.

Эфирный экстракт фильтруют через складчатый фильтр в предварительно взвешенную с точностью до 0,01 г круглодонную колбу емкостью 250 мл. Фильтр промывают, начиная с верхних краев, 10 мл смеси диэтиловогои петролейногоэфиров всоотношении1:1.

Дальнейшая отгонка растворителей и определение оставшихся липидов проводятся в описанной выше методике.

Обработка полученных результатов

Количество проэкстрагированных липидов (X1, мас. %) от массы кормовых дрожжей (М) определяется по формуле

где m1 – масса колбы с липидами, г; mо – масса пустой колбы, г; W – содержание влаги в исследуемом образце дрожжей, мас. %.

23

Содержание липидов в дрожжах после кислотной обработки (Х2) определяется по аналогичной формуле, в которой берутся значения m1 и mо применительно к этому случаю.

Степень извлечения липидов (У) из кормовой биомассы методом экстракции селективными растворителями определяется по формуле

У = (Х1/Х2)·100 %.

Величина потерь биомассы при экстракции липидов (П, мас. %) определяется по формуле:

П А0 А0 А1 100 Х1 ,

где Ао – масса кормовой биомассы, взятой для экстракции, г; А1 – масса биошрота после экстракции, г.

Техника безопасности при выполнении работы

Все растворители и экстракционная смесь огнеопасны! Все работы с ними разрешается проводить только под тягой вдали от открытых источников огня и электронагревательных приборов.

Контрольные вопросы

1.Классификация микробных липидов и области их применения.

2.Влияние условий культивирования микроорганизмов на состав и количество синтезируемых липидов.

3.Влияние вида микроорганизма на количество и состав образующихся липидов.

4.Какими растворителями может проводиться процесс экстракции микробного жира из биомасс?

5.Как осуществляется процесс получения биожира в промышленности?

6.Необходимость вспомогательных стадий при экстракции.

7.Влияние состава экстракционной смеси на технологичность процесса и количество извлекаемых липидов.

8.Что дает предварительная кислотная обработка (кислотный гидролиз) биомассы?

9.Какова ценность получаемого биошрота в зависимости от метода и степени извлечения липидов?

24

ТЕМА 4. ПРОДУКТЫ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ

Лабораторная работа 6 Спиртовое брожение

Обмен веществ микроорганизмов представляет собой единство двух основных процессов – конструктивного и энергетического. Синтетические возможности микроорганизмов и способы получения ими энергии отличаются большим разнообразием, поэтому столь же разнообразны и продукты их метаболизма. Значительная часть веществ, обнаруживаемых в микробных культурах, является результатом энергетического обмена. Например, при различных брожениях образуются спирты и летучие кислоты. Однако, кроме продуктов катаболизма в средах могут накапливаться вещества, связанные с конструктивными процессами. К таким веществам относятся аминокислоты, ферменты, антибиотики и др. Набор, количество и соотношение продуктов метаболизма заметно меняются в зависимости от стадии роста и условий культивирования микроорганизмов. Ряд продуктов жизнедеятельности микроорганизмов – различные органические кислоты, некоторые витамины, антибиотические вещества и многие другие – нашли широкое применение в практике. Определение продуктов обмена веществ микроорганизмов дает представление о путях использования ими тех или иных субстратов и необходимо для выявления продуцентов практически ценных метаболитов.

Среди дрожжей есть виды, способные к спиртовому брожению. Их давно используют для получения спирта, вина, пива, кваса, разрыхления теста. Спиртовое брожение протекает в несколько стадий.

Вначальный период, когда в среде содержится еще достаточное количество растворенного кислорода, дрожжи в основном окисляют

сахар до СО2 и Н2О и интенсивно размножаются. Брожение в данный период протекает слабо. Затем в результате обеднения среды кислородом дыхание клеток постепенно ослабевает, и начинается интенсивное брожение. Энергия брожения не обеспечивает высокого уровня размножения клеток, хотя синтез биомассы продолжается.

Вэтот период могут наблюдаться увеличение размеров клеток и на-

25

копление в них гликогена. В последней стадии брожения сахара в среде остается мало, дрожжи используют накопленный ранее гликоген, содержание которого в клетках падает.

Цель настоящей работы – сравнить скорости процессов брожения, определить количество этанола, образуемого в условиях опыта.

Работу проводят с одной из рас Saccharomyces cerevisiae. Среда: сахароза 15 %, пептон 0,5 %, КН2РО4 0,3 %, MgSO4 0,1 %

(массовые проценты).

Опыт ставят в нестерильных условиях, так как благодаря созданию элективных условий в среде будут развиваться преимущественно дрожжи.

Проведение испытания

В сосуд для брожения заливают 150 мл среды; вносят ~ 0,5 г прессованных (ресуспендированных в среде) дрожжей. Закрывают сосуд пробкой с затвором с серной кислотой и резиновым клапаном с прорезью (верхний конец резиновой пробки закрыт бусиной).

Затвор пропускает СО2, но задерживает выделяющуюся влагу (поглощается серной кислотой). Клапан через прорезь пропускает СО2 и не дает возможности наружному воздуху проникать в колбу.

Колбу взвешивают на технических весах с точностью до 0,01 г

иставят в термостат при 25 оС.

Оскорости брожения судят по количеству углекислоты, выделившейся в единицу времени из определенного объема среды.

Количество углекислоты устанав-

26

Динамика выделения СО2 в процессе брожения, осуществляемого дрожжами

Брожение обычно продолжается 2–4 дня. Завершение процесса устанавливают по прекращению газообразования.

При снятии опыта необходимо провести расчет количества образовавшегося спирта из сброженного сахара, исходя из массы выделившегося диоксида углерода в соответствии с уравнением спиртового брожения. Сделайте вывод о скорости протекания процесса спиртового брожения. Оцените интенсивность процесса по времени, рассчитайте получившийся выход и концентрацию спирта (в %).

Контрольные вопросы

1.Какиеусловиявлияютнаинтенсивностьспиртовогоброжения?

2.Почему в качестве гидрозатвора используется серная ки-

слота?

3.Как оценивается спиртообразующая способность различных штаммов дрожжей?

4.Какиеферменты участвуютвпроцессеспиртовогоброжения?

5.Какие стадии выделяют в процессе спиртового брожения, охарактеризуйте их.

Лабораторная работа 7 Дихроматно-йодометрический метод определения концентрации спирта

Дихроматно-йодометрический метод определения спирта широко распространен в виноделии, пивоваренном, спиртовом и ликерноводочном производстве. Основное преимущество метода заключается в том, что им можно достаточно точно определять спирт в небольших объемах жидкости. Метод дает хорошо воспроизводимые

27

результаты опытов при анализе водноспиртовых продуктов с содержанием спирта 0,5–25 %. Точность метода значительно повышается за счет йодометрического определения избытка дихромата калия.

Для гарантии полноты окисления спирта до уксусной кислоты избыток дихромата калия должен быть не менее 2–3 мл, а в сферу реакции всегда должно вводиться одно и то же количество спирта. Поэтому продукты с содержанием спирта 2–15 % разбавляют в 10 раз, а более концентрированные растворы – в 20 раз, однопроцентные растворы анализируют без разбавления. Опыт проводят при температуре 18–20 °С.

Вследствие высокой концентрации титрованного раствора дихромата калия измерение его в ходе опыта должно быть очень точным, так как ошибка в 0,1 мл дает отклонение в крепости ± 0,2 об.%.

На точность результатов анализа дихроматно-йодометрическим методом влияют примеси этилового спирта, которые также окисляются дихроматом калия, но эти погрешности значительно ниже тех, которые имеют место при пикнометрических и ареометрических определениях спиртавнизкоконцентрированных водноспиртовыхрастворах.

При определении спирта в винах, ликерах, наливках, пиве, спиртованном соке, морсе и бражке их вначале перегоняют.

Дихроматно-йодометрический метод определения спирта основан на окислении спирта дихроматом калия до уксусной кислоты. Избыток же дихромата калия, точно внесенного и непрореагировавшего, определяется титрованием йодистым калием по уравнению:

K2Сr207 + 6KJ + 7H2SO4 = 3J2 + 4K2SO4+Cr2(SO4)3+ 7H2O.

Выделившийся свободный йод титруют тиосульфатом натрия. При этом йод окисляет Na2S2O3 до тетратионата натрия, восстанавливаясь до J–:

2Na2S2O3 + J2 = 2 NaJ + Na2S4O6.

В ходе этой реакции присущая йоду темно-бурая окраска исчезает постепенно, поэтому для установления конца реакции применяется чувствительный реактив на свободный йод – раствор крахмала, который с йодом образует соединение интенсивно синего цвета.

28

Титрование заканчивают, когда ярко-синяя окраска раствора перейдет в голубовато-зеленую.

По количеству израсходованного тиосульфата натрия устанавливают расход дихромата калия, пошедшего на окисление спирта. Зная эквивалент раствора дихромата калия по спирту, определяют содержание этилового спирта в исследуемом растворе.

Эквивалент 0,5 н раствора К2Сr2O7 по спирту рассчитывают из реакции окисления спирта:

2К2Сr2O7 → 3С2Н5ОН, 2×294,22 г → 3×46,01 г, 0,0245 → Х г,

где Х – количество спирта, окисляемое 1 мл 0,5 н раствора К2Сr2O7, г; 0,0245 – содержание К2Сr2O7 в 1 мл 0,5 н раствора, г,

X 0,0245 3 46,01 0,00575 г 2 294,22

или 0,00575 : 0,789 = 0,0073 мл.

Следовательно, 1 мл 0,5 н раствора К2Сr2O7 эквивалентен 0,0073 мл спирта.

Реактивы:

1)0,5 н раствор дихромата калия;

2)0,1 н раствор тиосульфата натрия;

3)Серная кислота концентрированная;

4)1 % раствор крахмала;

5)10 % раствор йодида калия.

Проведение испытания

В коническую колбу вместимостью 500 мл отмеряют пипеткой 10 мл раствора К2Сr2O7 и осторожно по стенке прибавляют 5 мл серной кислоты. Когда колба остынет, в нее отбирают 5 мл испытуемого раствора. Спустя 15 мин (этого времени достаточно для окисления спирта при комнатной температуре) к смеси добавляют 10 мл 10 % раствора KJ и колбу прикрывают часовым стеклом.

29

Через 5 мин в колбу прибавляют 200–250 мл дистиллированной воды, и выделившийся йод титруют 0,1 н раствором тиосульфата натрия, прибавляя в конце титрования 2–3 мл 1 % раствора крахмала. Титрование заканчивают припоявлении голубовато-зеленойокраскираствора.

Количество спирта (С), т.е. концентрацию, определяют с учетом расхода 0,5 н раствора дихромата калия на его окисление и эквивалента 0,5 н раствора дихромата калия по спирту (1 мл раствора соответствует 0,0073 мл спирта),

С V1 V2 / 5 0,0073 100 , 5

где V1 – количество 0,5 н раствора дихромата калия, взятое на окисление спирта, мл; V2 – количество 0,1 н раствора тиосульфата натрия, израсходованное на титрование избытка дихромата калия, мл.

Контрольные вопросы

1.Преимущества и недостатки данного метода определения концентрации спирта.

2.Для каких спиртовых растворов применим данный метод?

3.Возможно ли определить концентрацию спирта данным методом в культуральной жидкости после проведения процесса спиртового брожения?

4.Какиеметоды определения концентрацииспиртавы знаете?

Лабораторная работа 8 Молочнокислое брожение. Получение йогурта

Молочнокислое брожение – процесс анаэробного окисления углеводов, основным конечным продуктом которого выступает молочная кислота. По характеру самого процесса и образующимся конечным продуктам различают гомо- и гетероферментативное молочнокислое брожение.

В основе гомоферментативного молочнокислого брожения лежит гликолитический цикл сбраживания глюкозы с образованием двух молекул пировиноградной кислоты. Последняя выступает ко-

30