книги / Основы биотехнологии

нечным акцептором водорода и восстанавливается до молочной кислоты под действием галактодегидрогеназы. При этом лактата образуется около 90 % и только 10 % приходится на другие продукты (этанол, ацетат, ацетон).

При гетероферментативном брожении метаболизм глюкозы осуществляется по пентозофосфатному пути с образованием помимо молочной кислоты углекислого газа, уксусной кислоты и этилового спирта, прирасходена синтезэтих веществдо50 % сбраживаемых гексоз.

Молочнокислое брожение осуществляют филогенетически неродственные микроорганизмы, объединяемые по признаку образования молочной кислоты. Они различны по морфологии (палочковидные, кокковидные, сферической или овальной формы), грамположительны, неподвижны, не образуют спор.

Молочнокислым бактериям принадлежит основная роль в осуществлении ряда процессов, лежащих в основе получения различных кисломолочных продуктов, сыров, сливочного масла, молочной кислоты, при биологическом консервировании (квашение, силосование), в приготовлении сырокопченых колбас, хлебных заквасок и др.

Гетеротрофные молочнокислые бактерии Bifidobacterium – преобладающая микробиота желудочно-кишечного тракта грудных детей, которая регулирует баланс между молочнокислыми и гнилостными бактериями (образуют лактат и ацетат).

Йогурт – один из древнейших продуктов, получаемых путем ферментации. Это кисломолочный продукт, схожий по консистенции

ивкусу с нежирной сметаной и получаемый в результате сквашивания молока специфическими йогуртовыми заквасками. Он считается полезным продуктом, поскольку помимо биологически активных веществ и витаминов содержит живые дружественные микрофлоре человека кисломолочные бактерии, которые поддерживают баланс микрофлоры в кишечнике человека, нормализуют работу желудочнокишечного тракта, стимулируют обменные процессы организма.

После термообработки (пастеризации) молоко заквашивают закваской йогурта. Главную роль здесь играют молочнокислые бактерии Lactobacillus bulgaricus, придающие продукту характерный вкус,

иStreptococcus thermophillus, которые добавляют особый сливочный

31

привкус. Для получения оптимальной консистенции продукта, вкуса и запаха эти микроорганизмы должны содержаться в культуре приблизительно в равных количествах. Кислоту в начале заквашивания образует в основном S. thermophillus. Смешанные закваски необходимо часто обновлять, поскольку повторные пересевы неблагоприятно отражаются на соотношении видов и штаммов бактерий: в них начинает доминировать L. bulgaricus.

Закваски на основе молочнокислых бактерий вырабатываются на предприятиях и в лабораториях по производству бактериальных препаратов в сухом (лиофилизированном) или жидком виде. Эти бактериальные препараты направляются на молочные предприятия, где путем последовательного их пересева в возрастающие объемы молока получают производственные закваски, используемые в производстве кисломолочных продуктов.

Оборудование и материалы:

1)емкости для йогурта – по количеству студентов в группе;

2)молоко пастеризованное;

3)сухой препарат йогуртовой закваски;

4)термостат;

5)стеклянная посуда.

Приготовление рабочей закваски (РЗ)

Перед приготовлением РЗ и кисломолочного продукта вся используемая посуда должна быть тщательно вымыта и простерилизована.

Нагреть 0,5–1 л молока до 36–40 оС. В небольшом количестве молока растворить при встряхивании сухой бакпрепарат (пробиотик) и после растворения перенести в подготовленное молоко, хорошо перемешать. Заквашенное молоко закрыть крышкой и поместить в термостат при температуре 36–40 оС на 12 ч.

Готовность сквашивания определяется по загустению молока. Получается белая, вязкая, слабокислая на вкус масса, похожая на свежеприготовленную простоквашу. Возможно расслоение или перекисание готового продукта, но это не вредит его дальнейшему использованию.

32

РЗ может использоваться для неоднократного заквашивания новых порций молока в течение нескольких дней при условии хранения в холодильнике и соблюдении асептических условий.

Приготовление кисломолочного продукта (КМП)

Для приготовления КМП можно использовать пастеризованное молоко любой жирности.

В нагретое молоко (36–40 °С) внести рабочую закваску из расчета 5–10 %, тщательно перемешать. Далее заквашенное молоко разлить в порционные закрывающиеся емкости (можно плотно закрыть фольгой) и поместить в термостат.

Поскольку сам по себе КМП является кислым (рН 3,7–4,3), для улучшения вкуса в порционные емкости предварительно следует внести небольшое количество варенья или фруктов.

Через 9–12 ч продукт готов. Рассмотрите под микроскопом микрофлору КМП, проведя окрашивание по Граму.

Дайте органолептическую характеристику полученного продукта.

Контрольные вопросы

1.Дайте характеристику морфологических и физиологических особенностей молочнокислых бактерий.

2.Объясните особенности молочнокислого брожения.

3.Что такое пробиотики и пребиотики?

4.В чем заключается лечебно-профилактическое действие

КМП?

5.Почему различные КМП имеют своеобразный вкус?

33

ТЕМА 5. ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ

Микробиологический контроль биотехнологических производств является обязательной и важной стадией общего контроля производства и управления технологическим процессом.

Важность микробиологического контроля обусловлена необходимостью обеспечения доминирования промышленного штамма на стадии культивирования и строгой последовательности биосинтетических процессов, гарантирующих эффективность производства целевого продукта высокого качества, а также требованиями создания экологически чистого производства с целью обеспечения безопасности занятого в производстве персонала и охраны окружающей среды.

Микробиологический контроль биотехнологических производств включает:

1.Микробиологическую характеристику жидкостных и воздушных потоков:

1.1.Определение инфицированности входящих потоков;

1.2.Определение санитарного состояния производственного оборудования и помещений.

2.Микробиологическую характеристику производственной культуры:

2.1.Определение чистоты (отсутствие контаминации) засевной

ипроизводственной культуры (при защищенных процессах) или доминирования производственного штамма (при незащищенном процессе);

2.2.Определение показателей физиолого-биохимического состояния культуры, определяющих получение целевого продукта требуемого качества.

3.Микробиологическую характеристику качества готового про-

дукта:

3.1.Определение общей обсемененности;

3.2.Определение живых клеток продуцента.

34

4. Санитарно-микробиологический контроль:

4.1.Состояние рабочей зоны;

4.2.Состояние отходящих потоков (воздух, вода) и окружающей

среды.

Показатели микробиологического контроля и критерии оценок этапов 1, 2 и 3 определяются требованиями технологического регламента и рабочими инструкциями. Методы контроля и допустимые показатели этапа 4.1 основаны на утвержденных нормах ПДК и влияния техногенных факторов в рабочей зоне (воздухе, рабочих поверхностях и т.п.).

Методы контроля и допустимые показатели по п. 4.2 основаны на нормах ПДВ и ПДС, утвержденных для каждого предприятия. Методы контроля и требуемые показатели по п. 3 определяются нормативно-техническими документами (технические условия, ГОСТ и др.) на выпускаемый продукт.

Определение по п. 2.1 проводится при осуществлении непрерывного процесса культивирования, поскольку в результате протекающих автоселекционных процессов может происходить изменение структуры популяции культивируемого штамма.

При защищенных процессах культивирования контролируется стерильность (т.е. отсутствие контаминации) входящих потоков, отсутствие контаминации засевного материала и готового продукта.

Лабораторная работа 9 Определение общей бактериальной обсемененности

Требования к качеству и биологической безвредности продукции, получаемой на основе микробиологического синтеза, сочетают условия высокой питательности, биологической активности и безупречного санитарно-токсикологического состояния.

Например, среди основных требований к товарным кормовым дрожжам регламентируется отсутствие в них живых клеток продуцента или продуцентов и незначительная бактериальная обсемененность (не более 150 000 клеток в 1 г товарного продукта).

35

Оборудование, материалы и реактивы;

1)термостат суховоздушный;

2)колбы конические на 250 мл – 2 шт.;

3)цилиндры на 100 мл – 2 шт.;

4)стерильные пипетки с расширенным концом на 1 мл – 3 шт.;

5)стерильные пипетки на 10 мл – 3 шт.;

6)стерильные чашки Петри – 6 шт.;

7)стерильные пробирки стеклянные – 4 шт.;

8)раствор физиологический рН 7,0 или вода водопроводная (стерильные);

9)шпатель микробиологический;

10)агар-агар;

11)пептон.

Проведение испытания

В стерильную пробирку берут навеску дрожжей (после определения влажности) массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,0002 г. К навеске добавляют 9 мл физраствора (рН = 7,0) или стерильной водопроводной воды и тщательно перемешивают стерильной стеклянной палочкой до получения однородной суспензии. После первого разведения 1:10 готовят следующие: 1:100,1:1000

и 1:10000.

Порядок разведения выбирают в зависимости от предполагаемой обсемененности продукта для того, чтобы на чашках развивалось 30– 300 колоний бактерий. Для приготовления каждого разведения используют отдельную стерильную пипетку с расширенным концом.

Посев производят из двух-трех разведений. Каждое разведение высевают на 2–3 чашки Петри. По 1 мл суспензии вносят в чашку Петри и заливают 12–15 мл расплавленного и охлажденного до 45 оС МПА. Содержимое чашки тщательно перемешивают осторожными вращательными движениями для равномерного распределения посевного материала.

После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и инкубируют в термостате при 37 оС в течение 48 ч.

36

Обработка результатов

Количество выросших колоний (КОЕ) подсчитывают в каждой чашке. Оценку результатов производят по посеву того разведения,

вкотором количество выросших колоний составляет от 30 до 300. По результатам подсчета вычисляют среднее арифметическое значение числа колоний во всех посевах этого разведения. Если в двух следующих друг за другом разведениях количество колоний на чашках находилось в пределах 30–300, то подсчитывают количество колоний

вкаждом из этих разведений при условии, что полученные результаты не отличаются друг от друга более чем в два раза. В противном случае результаты посева оценивают по наибольшему разведению.

Количество бактерий в 1 г продукта вычисляют умножением среднего арифметического значения на соответствующее разведение навески.

Контрольные вопросы

1.Как определить доминирование производственного штамма микроорганизмов в культуральной жидкости?

2.Какие требования соблюдаются при выполнении микробиологических исследований?

3.Охарактеризуйте структуру микробиологического контроля биотехнологических производств.

4.Назовите основные методы, используемые при микробиологическом контроле биотехнологических производств.

5.Как обрабатываются отработанный материал и посуда после проведения микробиологических работ?

6.Объясните порядок проведения разведений при посеве микроорганизмов на твердые среды.

37

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОФОРМЛЕНИЮ ОТЧЕТА

Каждый отчет должен содержать:

–дату выполнения работы;

–заголовок;

–теоретическую часть;

–методики выполнения анализов;

–наблюдения при выполнении работы;

–основные расчеты по полученным результатам;

–объяснение полученных результатов;

–выводы по работе.

Теоретическая часть отчета включает в себя принцип метода анализа и его физико-химические основы.

Результаты измерений оформляют в виде таблиц, необходимые расчеты приводят под таблицей.

38

ПРАВИЛА ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ

При выполнении анализов используются различные реактивы, среди которых имеются ядовитые (аммиак, концентрированные кислоты, перекись водорода и др.), огнеопасные (ацетон, спирты, эфиры). В процессе экспериментов проходят реакции, сопровождающиеся выделением ядовитых газов, применяются электронагревательные

иработающие под давлением приборы, пользование которыми требует соблюдения мер предосторожности.

Студент на лабораторных занятиях по биотехнологии всегда должен помнить, что имеет дело с микроорганизмами, которые далеко не всегда могут быть безвредными для его здоровья. Поэтому на практических занятиях он обязан соблюдать правила личной гигиены

итехники безопасности при работе в химической и микробиологической лабораториях.

Общие правила работы в лаборатории

1.К работе в лаборатории допускаются студенты, прослушавшие инструктаж по ТБ и расписавшиеся в контрольном листе.

2.Работать в лаборатории разрешается только в халатах

исменной обуви.

3.В лаборатории запрещается принимать пищу, пить напитки

ихранить продукты питания.

4.С первых дней работы в лаборатории студент должен приучить себя к аккуратности и внимательности, отсутствие которых

нередко бывает причиной искажения результатов эксперимента,

атакже может привести к несчастным случаям.

5.В работе нужно пользоваться только незагрязненными реактивами, чистой посудой, промытой дистиллированной водой.

6.Нельзя высыпать загрязненный реактив обратно в склянку с чистым реактивом.

7.При работе с культурами микроорганизмов следует использовать стерильные среды, посуду. При посевах и пересевах микроор-

39

ганизмов пользоваться только стерильными бактериологическими петлями, шпателями.

Порядок выполнения лабораторных работ

1.Предварительно перед проведением лабораторной работы внимательно ознакомиться с её содержанием.

2.Не начинать работу, пока не проверено наличие всего необходимого для проведения работы (посуды, приборов, реактивов).

3.При выполнении работы точно соблюдать порядок и последовательность операций, указанных в руководстве; пользоваться растворами только указанной концентрации и соблюдать рекомендуемую дозировку.

4.Соблюдать все необходимые меры предосторожности (в случае необходимости работать под тягой, осторожно работать с горючими и едкими веществами и т.д.).

5.Все микробиологические работы проводить в простерилизованном боксе над пламенем горелки.

6.Запись наблюдений и хода работ фиксировать в тетради (лабораторном журнале). Не следует делать записи на черновиках, отдельных листах бумаги, так как они легко могут затеряться.

7.Все препараты и отработанную посуду, бывшие в контакте

смикроорганизмами, подвергатьдезинфекцииизатем тщательно мыть.

8.По окончании работы привести в порядок рабочее место, вымыть посуду, включить бактерицидную лампу в боксе, вымыть руки мыльным раствором.

Общие правила работы в химической лаборатории

1.Нельзя пробовать на вкус и вдыхать химические вещества. Сухие реактивы во избежание ожогов нельзя брать руками, необходимо пользоваться шпателем.

2.При работе со стеклянной посудой следует помнить о хрупкости стекла, не допускатьбитья посуды, чтоможет привести ктравмам.

3.Все работы, связанные с выделением ядовитых газов и паров, проводятся в вытяжном шкафу. С ядовитыми веществами работают

вперчатках.

40