6. Практика Современные методы выявления дисбактериоза кишечника.

Методы выявления дисбактериоза

 общее клиническое обследование

 копрологическое исследование

 метод газожидкостной хроматографии

 микробиологическое исследование кала, которое включает определение наличия и концентрации наиболее значимых микроорганизмов: бифидобактерии, лактобактерии, кишечная палочка и ее ферментативные варианты, условно-патогенные энтеробактерии, стафилококки, энтерококки, бактероиды, клостридии, грибы.

Этапы исследования микрофлоры кишечника

Правильный забор и транспортировка материала определяют успех бактериологического исследования.

• Материал забирают из последней порции фекалий стерильным шпателем и помещают в стерильный контейнер. Учитывая, что строго анаэробные неспорообразующие бактерии должны быть защищены от летального действия кислорода, рекомендуют использовать пробирки с хорошо притертыми резиновыми пробками, заполненные инертной газовой смесью, или осуществлять транспорт материала, используя Gas Pak. От момента взятия материала до начала посева должно проходить не более 2 ч.

• Подготовка материала к посеву. Навеску в 1 г фекалий переносят в стерильную ступу и добавляют 9 мл стерильного свежерегенерированного кипячением в течение 20 мин тиогликолевого буфера, который способствует лучшему сохранению анаэробных бактерий. Материал тщательно растирают пестиком до образования гомогенной массы, которую переносят в стерильную пробирку (разведение 1:10). Далее производят серийные стократные разведения гомогената в тиогликолевом буфере (10-3 , 10-5 , 10-7 , 10-9 ), перенося из предыдущей в последующую пробирку, содержащую 9,9 мл тиогликолевого буфера.

• Посев исследуемого материала и определение количественного и качественного состава микрофлоры — Определение общего числа аэробных бактерий и их гемолизирующих свойств осуществляют путем посева капли объемом 0,05 мл из разведений 10-5 и 10-7 на два сектора 5% кровяного агара. Через 24 ч инкубации при температуре 37 °С проводят подсчет и микроскопию окрашенных по Граму мазков из 125 различных типов колоний. Определяют общее количество аэробных бактерий, а также процентное соотношение гемолизирующих культур среди колоний одного типа.

— Количество стафилококков учитывают на ЖСА, на который осуществляют посев на два сектора каплями объемом 0,05 мл из разведений 10- 3 и 10-5 . После инкубации в течение 48 ч при температуре 37 °С подсчитывают количество всех выросших колоний, определяют наличие у них лецитовителлазной активности (наличие радужного венчика). Колонии, различные по культуральным свойствам, пересевают секторами на МПА и 5% кровяной агар. Через сутки инкубации при температуре 37 °С определяют их плазмокоагулазную активность (со стерильной кроличьей плазмой, разведенной в соотношении 1:5 через 30 мин и 4 ч в термостате), а также ферментацию маннита и мальтозы в анаэробных условиях.

— Дрожжеподобные грибы выделяют на среде Сабуро с полимиксином (200 мг/мл), для чего проводят посев каплями объемом 0,05 мл из разведений 10-3 и 10-5 . Посевы инкубируют 72 ч при температуре 240 °С. После инкубации подсчитывают количество бело-матовых выпуклых колоний, делают из них мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При необходимости для определения видовой принадлежности необходимо провести биохимическую идентификацию с помощью специальных тест-систем. Для определения вида C. albicans колонии, крупные при окраске по Граму, почкующиеся грампозитивные бактерии удлиненной формы пересевают на рисовый агар. На рисовом агаре через 48-72 ч наблюдается наличие хламидоспор, что является признаком C. albicans.

— Определение общего количества бактерий семейства Enterobacteriaceae .Делают посев каплями объемом 0,05 мл из разведений 10-3 , 10-5 и 10-7 на 3 сектора чашки со средой Эндо или Левина. Кроме того, проводят посев шпателем материала из разведения 10-3объемом 0,1 мл на среду Плоскирева (Эндо) и из разведения 10-5 объемом 0,1 мл на среду Эндо. После 24-часовой инкубации при температуре 37 °С подсчитывают количество различных типов колоний, которые потом идентифицируют по биохимическим тестам (с помощью сред Клиглера, энтеротеста, API-системы).

Следует учитывать, что на средах Эндо, Левина, Мак-Конки могут расти в виде лактозонегативных колоний оксидазопозитивные бактерии, такие как представители рода Pseudomonas, поэтому перед биохимической идентификацией необходимо провести тестирование лактозонегативной колонии на оксидазную активность.

После биохимической идентификации подсчитывают общее количество энтеробактерий, E. coli,а также различных представителей семейства Enterobacteriaceae. Среди общего количества E. Coli определяют количество лактозопозитивных, лактозонегативных, гемолитических кишечных палочек.

Для целенаправленного выделения патогенных энтеробактерий (сальмонелл, шигелл) из исходного разведения 1:10 делают посев в селенитовый бульон с последующим выделением возбудителей на средах Плоскирева, висмутсульфитном и гектоеновом агарах.

Молочнокислые палочки (лактобактерии) выделяют на среде МРС, делая высев из разведений 10-5 и 10-7 каплями объемом 0,05 мл. Поскольку лактобактерии являются аэротолерантными бактериями, их культивируют в СО2-инкубаторе или в Gas Pak. После инкубации подсчитывают все виды выросших колоний, делают мазки из различных типов колоний. Лактобактерии - грамположительные палочки, расположенные частоколом. Подтверждение принадлежности бактерий к роду - морфология, отсутствие оксидазы и каталазы.

Для выделения бифидобактерий используют полужидкую свежерегенерированную кипячением в течение 30 мин среду Блаурокка. Посев материала проводят из разведений 10-5, 10-7 и 10-9 в объеме 1 мл в 9 мл среды. Посевы выдерживают 48 ч при температуре 37 °С. Далее проводят микроскопию мазков из выросших колоний, для чего пастеровской пипеткой отбирают колонии в виде гвоздиков, комет, дисков. В мазках бифидобактерии имеют вид разветвленных палочек (Х, У) с утолщением на концах.

Спорообразующие бактерии (клостридии) выделяют путем посева 1 мл материала из разведений 10-3, 10-5 и 10-7 в растопленный столбик среды Вильсона-Блера. После инкубации подсчитывают количество выросших колоний черного цвета в глубине агара. Следует учитывать, что клостридии растут очень быстро и часто из-за образования газа происходят разрывы среды, поэтому пробирки следует инкубировать в течение ночи при температуре 24 °С, а затем несколько часов при температуре 37 °С. Количество микроорганизмов в 1 г фекалий определяют по числу колоний, выросших на соответствующей среде, с учетом посевного материала и степени его разведения.

Количество микроорганизмов в 1 г фекалий рассчитывают по формуле: КОЕ/г = n × а × в, где КОЕ - колониеобразующие единицы; n - число колоний, выросших на питательной среде; а - коэффициент посевной дозы (а=10 при посеве 0,1 мл; а=20 при посеве 0,05 мл); в - степень разведения посевного материала. 6.4.4. Микробиологическая диагностика бактериального вагиноза